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黑素皮质素受体 3 和 4(melanocortin receptor 3 and 4,MC3R 和 MC4R)是黑素皮质素(MCR)家族的成员。MCR共有5种不同类型的同源受体(MC1R～MC5R),属于视紫红家族最小的G蛋白偶联受体(GPCR),具有7个跨膜α螺旋结构。目前,5种类型的MCR在不同种类脊椎动物中都有研究。MCR涉及多种生理功能的调节,如色素沉着、摄食、应激、能量平衡、类固醇产生、脂肪分解、免疫调节、性功能和心血管调节等。团头鲂(Megalobrama amblycephala),鲤科,鲂属,俗称武昌鱼。它广泛分布于长江中下游,因其具有生长快,肉质优良,存活率高等特点,20世纪60年代以来,水产养殖产量大幅增长,是我国重要的经济养殖经济品种。在本研究中,通过转录组测序、扩增引物设计和cDNA末端快速扩增技术(RACE)等技术,成功克隆了团头鲂mc3r和mc4r(Mammc3r和Mammc4r)的cDNA全长序列。运用生物信息学软件对预测的蛋白结构进行分析,采用荧光定量PCR(RT-PCR)技术构建了团头鲂mc3r和mc4r组织表达图谱,掌握了禁食状态下mc3r和mc4r的表达变化。同时制备了团头鲂MC4R抗体,运用免疫组化的技术手段对中枢及外周组织中的MC4R进行定位和定量分析。主要结果如下:1.通过转录组测序获到mc3r部分序列972bp,进一步克隆扩增获得cDNA全长1729bp。其非编码序列包含5’端109bp和3’端636bp,编码区长984bp,编码327个氨基酸。同源性比对及系统发育分析显示,团头鲂MC3R(MamMC3R)的氨基酸序列与斑马鱼、鲤鱼和鲫鱼的MC3R同源性分别高达94%、96%、96%,而与人类、牛和鼠的MC3R同源性为69%-76%。RT-PCR检测表明,mc3r在团头鲂不同组织中都有广泛地表达,在下丘脑和垂体中有较高的表达,其次是卵巢,精巢、肌肉、肝、脾,而在眼、头肾、鳃、心脏、肾、肠和表皮中表达量较低。禁食试验结果显示,在禁食24 h内,实验组与对照组中的mc3r表达没有显著差异,呈现先上升后下降的昼夜节律变化。禁食达到48h,实验组垂体和卵巢中mc3r表达量显著上调,72h时,下丘脑、垂体和肝脏中mc3r显著上调,恢复投喂后,下丘脑和肝脏中mc3r显著下调。禁食达到14d,下丘脑、肝脏中的mc3r表达量明显高于对照组,血浆皮质醇水平显著升高,血糖水平也显著降低。2.通过RACE等技术克隆得到mc4rcDNA全长1575bp,包含5’端15bp和3’端579 bp的非编码序列,以及981bp的编码区,编码326个氨基酸。团头鲂MC4R(MamMC4R)的氨基酸序列与斑马鱼、草鱼和翘嘴红鲌的MC4R同源性分别高达98%、99%、99%,与人类、牛、鼠和鸡的MC4R同源性为67%-72%。RT-PCR检测结果表明,mc4r在组织中广泛地表达,下丘脑中表达量最高,其次是卵巢、眼、垂体和肝脏,而在表皮、鳃、头肾、心脏、肾、脾、肠、肌肉和精巢中表达较低。禁食试验结果显示,在禁食24 h内,实验组与对照组中的mc4r表达没有显著差异,层现先上升后下降的昼夜节律变化。禁食48 h,垂体和肝脏中mc4r明显上调,72 h时,下丘脑和肝脏中mc4r表达上调;恢复投喂后,mc4r表达显著下调。当禁食时间达到14d时,下丘脑和垂体中的mc4r表达明显上调。免疫组化结果显示,MC4R在检测的组织中都有阳性表达。在肠道组织切片上,阳性反应主要出现在粘膜下层与固有层中,浆膜、环形肌层以及肠上皮层中也有少量表达;在肝组织中,肝细胞膜上可见阳性蛋白表达,中央静脉等血管附近偶见阳性反应的白细胞,肝管和管汇区结缔组织与上皮细胞中可见阳性反应;在卵巢组织中,阳性反应主要出现在滤泡膜,核膜以及卵黄颗粒周围;在精巢组织中,阳性反应主要出现在间介组织中,精母细胞和精子细胞中未见阳性反应;在眼中,视网膜上除外核层外均为阳性反应,脉络层以及巩膜外侧上皮层亦为阳性反应;在下丘脑中,下丘脑中可以观察到后部,腹侧部以及内侧纵束附近存在阳性表达;在垂体中,神经垂体和腺垂体都有阳性表达。