布鲁氏菌病(Brucellosis,又称布氏杆菌病、地中海弛张热、马耳他热、波浪热或波状热,简称布病)是由布鲁氏菌(Brucella)引起的一种变态反应性人畜共患传染病。其最早于1887年由David Bruce在患病死者脾脏中发现并分离鉴定。我国则在1905年首次报道该病流行。目前,除少数发达国家以外,布病在全球160多个国家流行。布病作为重要的人畜共患病之一,其主要感染牛、羊、猪和犬等动物,其中以牛和羊的感染情况最为严重。布病可通过消化道、皮肤黏膜以及垂直传播等多种方式引起动物感染,其中最为危险的传染源为患病的妊娠动物,布鲁氏菌可伴随流产或分娩时的胎儿、胎衣和羊水排出,另外乳汁也是重要的传染源之一。布病最为显著的临床症状为生殖障碍,引起怀孕母畜流产,常见于妊娠中后期,且长期不孕;对于公畜来说,则引起睾丸炎和附睾炎,严重影响生殖性能。布病常伴随着波状热、关节炎等其他临床症状的发生。另外,布鲁氏菌作为胞内寄生菌,一旦感染个体后难以通过抗生素治疗,即使动物自愈,仍然有持续排菌的危险,所以免疫加检疫是控制和预防布病的基本方式。目前布病是《中华人民共和国传染病防治法》规定的35种传染病中的乙类传染病,同时并被列为二类传染病。目前,对于布病的检测方法大都建立在体液免疫基础上,传统的检测方法有虎红平板凝集试验(RBPT)、试管凝集试验(SAT)、补体结合试验(CFT)等,但传统方法耗时较长,方法繁琐且判断较为困难,结果判定十分依赖于相关人员的经验。上世纪70年代,随着相关技术的发展,酶联免疫吸附试验(ELISA)和荧光偏振实验(FPA)也被应用于布病的检测之中。然而由于技术限制,我国使用的动物布病ELISA检测试剂盒一直被国外厂商垄断,使得产生了高昂的检测成本;而且,我国现有的预防动物布病的疫苗如猪种S2株、牛种A19株和羊种M5株均为光滑型菌株,其免疫后产生的抗体与自然感染之间存在干扰,使得现有手段无法区分动物的具体状态。国外有些国家(如美国、加拿大等)通过使用粗糙型疫苗的方式解决了该问题,但由于我国还未有有效的粗糙型疫苗使用,使得我国对于动物布鲁氏菌的有效检疫和及时淘汰变得更加困难。为了解决上述问题,本研究针分别建立了针对动物布鲁氏菌病的竞争ELISA抗体检测试剂盒和牛布鲁氏菌病间接ELISA抗体检测方法,同时建立了针对牛布鲁氏菌IgM亚型抗体的检测方法,构建了不同感染/免疫状态下的动物模型,并借鉴了之前的研究,确定了不同状态下牛体液免疫情况,建立了基于牛不同布鲁氏菌抗体亚型的鉴别诊断方法。同时,本研究针对现有检测手段均仅限于检测体液免疫状态的局限,通过对刺激源的选择,并借鉴牛结核分枝杆菌病的相关手段,建立了针对牛布鲁氏菌的ifn-γ释放试验的检测方法。本研究通过单克隆细胞制备技术筛选到针对布鲁氏菌的特异性单抗细胞株(4c3株),并通过棋盘交叉法确定了包被浓度、酶标抗体稀释度、样品稀释度、样品稀释液等条件,建立了动物布鲁氏菌抗体竞争elisa检测方法。在此条件下该方法的敏感性为97.9%,特异性为96.3%。本研究同时以提纯的布鲁氏菌脂多糖(lps)抗原,按照上述方法分别建立了针对布鲁氏菌特异性igg和igm亚型抗体的检测方法,其敏感性分别达到97.7%和95.7%,特异性分别为95.5%和92%。而且,上述建立的间接elisa方法对与布鲁氏菌具有相同抗原为点的小肠结肠炎耶尔森氏菌o:9和大肠杆菌o:157抗血清无交叉反应性,证明了本研究建立方法的良好特异性。本研究在建立的分别针对布鲁氏菌igg和igm抗体亚型检测方法的基础上,通过构建易感动物(奶牛)模型,获得我国常用疫苗(猪种布鲁氏菌s2弱毒苗和牛种布鲁氏菌a19弱毒苗)以及标准强毒株(牛种布鲁氏菌2308株)的抗体规律。通过检测发现,s2疫苗口服后在整个检测期内(0~150天)其igg的含量均低于临界值,而igm则在免疫15天后达到最高,之后逐步下降,并在免疫后60天后低于临界值;皮下注射a19免疫组其igg和igm则在15天后即达到高峰,之后均迅速下降,igg在感染后90天,igm则在60天后低于临界值;与s2组和a19组不同,攻毒对照组其igg在21~30天时出现后则一直保持稳定水平,而igm亚型抗体出现时间也比免疫组延迟,迅速达到高峰后持续下降。这表明不同疫苗之间以及与野毒株之间其抗体亚型有明显的差别,通过这些区别,可以通过检测抗体亚型的方法来对牛群不同状态进行鉴别。为了验证本方法的可行性,本研究对背景清晰的50份样本进行检测,通过上述建立的鉴别诊断方法,判断了其真实状态,除个别因处于交叉范围外,其他样本(46/50)均可进行实施鉴别诊断,准确度为92%。本研究通过借鉴牛结核病的ifn-γ相关检测方法,确定了1.0×107cfu/ml的灭活牛种2308抗原作为牛布鲁氏菌病ifn-γ释放试验的最佳抗原,并对感染牛群进行检测,结果发现ifn-γ释放试验可将检测时间点提前到感染后5天,相较于传统抗体检测方法,提前了2~3周。说明该方法可以增强对于布鲁氏菌病的检测效果,对于尽早发现和处理阳性个体具有重要意义。最后,本研究建立的动物布鲁氏菌竞争ELISA检测方法、牛布鲁氏菌间接ELISA检测方法能够有效检测牛布鲁氏菌病的感染,相较于传统检测方法更加方便快速,并具有良好的符合率;而牛布病IgM亚型抗体间接ELISA检测方法对于准确分析感染时期具有重要意义;而基于抗体亚型的鉴别诊断方法解决了疫苗免疫与自然感染无法鉴别的问题;而IFN-γ释放试验对于布病早期诊断的早期诊断具有重要意义。