真核生物和原核生物在物理、化学和生物应激因素(如高温、多环芳烃、病毒感染等)的作用下,机体会迅速启动高度程序化的热休克反应(heat shock response,HSR),诱导合成一组高度保守的热休克蛋白(heat shock proteins, HSPs)。HSPs是生物界(包括从细菌到人类)经过长期进化仍保留下来的、对体内外不良因素起保护作用的一类蛋白质。根据HSPs在SDS-PAGE上的结果,按其分子量大小将HSPs分为如下几个家族:大分子HSPs (≥100 KD),HSP90 (81 - 99 KD),HSP70(65 - 80 KD),HSP60(55 - 64 KD),HSP40(35 - 54 KD),小分子HSPs(≤34 KD),其中最为主要和重要的是HSP70家族的Hsp70。许多研究提示了其可能的作用和功能如下:1) Hsp70保护细胞或生物免遭各种应激因素的损害,赋予它们从各种应激中恢复的能力;其中,表现最为明显的是热耐受能力的形成,即当细胞或生物接触亚致死温度后,表现对致死温度的存活率明显增加,并且对其他性质的致死性应激的抵抗能力也可能增强;2) Hsp70对细胞内重要遗传物质DNA可能具有重要保护作用,且在生物生长、发育和分化过程中也起着重要作用;3) Hsp70与体内许多重要生物活性物质(如类固醇、肿瘤坏死因子等)有着密切的联系,参与体内许多调节过程;4)更重要的是,Hsp70作为分子伴侣,促进蛋白质的合成、折叠、装配和运输,还参与变性蛋白质的清除,这种重要功能可能与热耐受、毒物耐受有关。苯并(a)芘(BaP)是一类来源于有机物不完全燃烧、有致癌性的多环芳烃,可以和DNA结合形成加合物,这样的损伤经由核苷酸切除修复途径修复。此外,在BaP代谢过程中产生的反应活性氧(ROS)也能对生物大分子造成损害。ROS对DNA造成的损伤经由碱基切除修复途径修复。本实验在人群和细胞水平的研究结果显示Hsp70的表达水平和残留的BaP导致的DNA损伤负相关,提示Hsp70可能在对BaP所致DNA损伤的修复方面发挥了一定作用。Hsp70正常时主要分布在细胞浆,而有害因素应激时转移入核,且分布于染色体周围,这个重要现象也提示了Hsp70在DNA保护中的可能作用与意义。DNA修复在肿瘤形成和治疗方面是一个重要的研究方向,而既往的大多数研究从不同的DNA修复途径分别研究它们的重要作用与机制。而多数情况下,环境有害物质对DNA造成的损伤需要多种修复途径共同进行修复,需要同时考虑多种蛋白质在DNA修复中的作用。Hsp70是重要的分子伴侣,参与蛋白质的合成、折叠、装配、运输和变性蛋白质的清除等,无疑它也可能与DNA修复相关蛋白有关。本研究通过构建高表达和低表达Hsp70两种细胞模型,用BaP处理细胞,利用彗星实验、宿主细胞再活化实验来观察Hsp70表达水平不同细胞中修复能力的差异,同时用免疫共沉淀和高效液相色谱-电喷雾-串联质谱检测在DNA修复过程中和Hsp70结合存在的各种蛋白,从中筛选出可能的Hsp70作用底物。并对筛选出来的Hsp70交互作用蛋白利用免疫共沉淀、激光共聚焦和放射性自显影进行进一步的确证,为阐述Hsp70在BaP染毒修复过程中的作用机制提供科学依据。本研究共分四部分。第一部分高和低表达Hsp70细胞模型的建立对于Hsp70高表达细胞模型的建立,我们通过转染16HBE细胞pcDNA3.1/pcDNA3.1-hsp70重组质粒,并用G418筛选稳定的Hsp70高表达细胞株(16HBE/hsp70)。用转染空载体质粒pcDNA3.1的16HBE细胞作为转染对照(16HBE /pcDNA)。对于Hsp70低表达细胞模型的建立我们采用了槲皮素抑制Hsp70表达和RNA干扰技术两种方法,通过对Hsp70的表达水平的验证对进行两种方法的效果进行比较。槲皮素(QCT)是一种广泛存在的生物黄酮类物质,可以抑制某些肿瘤细胞Hsp70的合成,使Hsp70表达降低。我们首先采用不同浓度槲皮素(50、100、150、200μM)处理16HBE细胞6h,监测细胞存活率的同时用Western-blot技术检测槲皮素处理后,16HBE细胞中Hsp70蛋白的表达。结果发现,随着槲皮素浓度的增加,16HBE细胞的Hsp70的表达呈下降趋势。50μM槲皮素处理时,Hsp70表达即观察到显著下降(P<0.01),这样一直到200μM。而细胞存活率在浓度小于150μM时,均大于90%,在QCT浓度为150μM时,细胞存活率为87%。因此,结合Western Blot和细胞存活率实验,最终确定100μM槲皮素处理6h作为抑制Hsp70表达的模型,0.01%的DMSO处理作为溶剂对照(16HBE/DMSO)。RNA干扰(RNAi)是近年来发展起来的一种研究基因功能的新方法。RNA干扰是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。近几年来RNAi研究取得了突破性进展,被《Science》杂志评为2001年的十大科学进展之一,并名列2002年十大科学进展之首。由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达,该技术已被广泛用于探索基因的功能。运用这项技术时,可以通过转染编码shRNA的质粒、小干扰RNA等达到特异性降低目的基因的目的。在本研究中,采用转染质粒的方法,在瞬时转染48小时后,对Hsp70的表达进行检测,从而对沉默效果进行评估。最后我们对高表达和低表达Hsp70的细胞模型进行了鉴定。利用细胞免疫荧光技术和Western-blot技术检测各组细胞中Hsp70的表达。细胞免疫荧光结果发现RNAi组细胞(16HBE/RNAi)的荧光强度明显低于正常培养的16HBE组细胞,而高表达Hsp70组(16HBE/hsp70)细胞的胞浆内荧光强度明显高于正常培养的16HBE组细胞;Western-blot检测发现,与16HBE组相比,16HBE /RNAi组Hsp70表达降低了42% (P﹤0.01),16HBE /hsp70组Hsp70表达增加了78% (P﹤0.01)。16HBE /DMSO、16HBE/HK和16HBE /pcDNA组Hsp70的表达未见明显变化(P > 0.05)。槲皮素浓度为100μM时,对Hsp70的表达抑制了53%,稍高于沉默组,但是由于槲皮素对Hsp70的抑制是非特异性的,因而采用RNA干扰技术进行后续的相关研究。第二部分Hsp70在B(a)P、BPDE所致DNA损伤修复中的作用为比较B(a)P染毒后,不同Hsp70表达水平的16HBE细胞DNA修复能力的差异,本部分首先用彗星试验检测16μM BaP染毒16HBE细胞2h,恢复不同时间(0,2,4,8,24h),Hsp70表达水平不同的细胞对DNA损伤的修复差异。所设八组细胞Control、16HBE/HK、16HBE /RNAi、16HBE /hsp70、16HBE/pcDNA、DMSO、S9、NC(normal cultured)在处理后存活率均大于80%,并且在DMSO、S9和NC组中,存活率大于90%,均符合毒理学要求。彗星实验结果表明随着恢复时间的延长,各组细胞OTMs均下降,说明残留DNA损伤的减少。在恢复前2h内,降低迅速,提示这个时间段为修复最活跃阶段。在2h到8h,速度减慢。24h后,OTMs基本达到正常水平(NC,normal cultured,显示正常培养时的OTMs),提示修复过程基本完成。高表达Hsp70组在修复最活跃的前2h相对于对照组,OTMs值降低更迅速,说明高表达Hsp70组修复进行得更快。并且在恢复的各个时间点,高表达Hsp70组残留的OTMs值均小于对照组,且差异有极显著性(P<0.01)。而在低表达Hsp70组中,在修复最活跃的前2h内OTMs的降低速度和对照组相比明显减慢(P<0.01)。由此可见,在修复最活跃的前2h的结果提示,Hsp70参与了BaP造成的DNA损伤的修复过程,它可以促进细胞对这种损伤的修复。这可能与作为分子伴侣的Hsp70可以帮助变性受损的蛋白质复性或降解有关,高表达的Hsp70增强了分子伴侣作用,保持了蛋白质的稳态,减轻了细胞的损伤。BPDE是BaP的代谢终产物,可以与DNA的亲核位点,即鸟嘌呤的外环胺基端共价结合形成BPDE-DNA加合物,导致特异性突变。这样的加合物损伤可以通过核苷酸切除修复(NER)途径修复,如果没有得到及时有效的修复就会导致肿瘤的形成。Hsp70是HSPs家族中的重要成员,多项研究显示在DNA毒性应激因素作用下,Hsp70的表达水平和残留的DNA损伤负相关。有研究发现这种伴侣蛋白在碱基切除机制修复(BER)和错配修复(MMR)中都发挥了一定的作用,但在NER方面,真核生物方面尚缺乏相关研究。故本部分拟在这方面作一些探讨,研究Hsp70是否参与了对BPDE所致加合物损伤的核苷酸切除修复。宿主细胞再活化实验(HCR)是通过瞬时转染被不同浓度BPDE(10、20、30、40μM)损伤的萤火虫荧光素酶报告基因的pCMVluc质粒,40h后检测宿主细胞对损伤质粒DNA的修复情况,根据宿主细胞表达荧光物质的含量来评估宿主细胞的DNA整体修复能力。高表达Hsp70组相对对照组,荧光素酶的表达明显提高,说明对加合物损伤的修复能力的增强,且在10μM时,P<0.01,在20μM时,P<0.05。低表达Hsp70组相对对照组,荧光素酶的表达显著降低,提示其修复能力的减弱,且在10μM时,P<0.05。第三部分BaP作用下Hsp70交互作用蛋白的鉴定本研究第二部分的研究结果显示,Hsp70表达不同的16HBE细胞在对BaP、BPDE所致DNA损伤的修复中,表现不同的修复能力。这样的结果提示Hsp70可能在这一过程中发挥了作用。Hsp70作为一种分子伴侣,可以帮助蛋白质维持正确的构象、对变性蛋白进行修复或者降解,因此,我们猜想可能存在一些蛋白底物,Hsp70通过和这些蛋白底物作用而在DNA修复过程中发挥一定的作用。在本部分中,16μM B(a)P染毒16HBE细胞2h恢复4h后,运用免疫共沉淀把在修复过程中和Hsp70有交互作用的所有蛋白沉淀下来,并对其进行高效液相色谱电喷雾串联质谱分析(HPLC ESI MS/MS)。样本中总共有730种蛋白被检测,我们对其中含量较高的84种蛋白进行了分析,根据swiss-prot database蛋白质数据库(http://www.expasy.org)提供了蛋白质的各种说明,包括蛋白名称、起源、功能、交互作用、结果等,把这84种蛋白分成了13个功能组,分别是细胞结构和移动(14%)、蛋白质代谢和修饰(12%)、DNA稳定性(6%)、细胞内和细胞间信号(7%)、细胞分化和增殖(74%)、蛋白交互作用(6%)、凋亡(5%)、核酸代谢(5%)、生理功能的执行(6%),细胞损伤保护(2%)、能量代谢(1%),未知部分和其他部分(27%)。从结果可见,在修复过程中,Hsp70不仅和参与生理功能的蛋白质有交互作用,而且和维持DNA稳定、抵抗细胞损伤的蛋白质之间也有交互作用,Hsp70可能是通过复杂的功能网络参与BaP所致损伤的修复,这为进一步阐述Hsp70在修复过程中所发挥的多重功能提供了线索。第四部分BaP作用下Hsp70和CKII的交互作用及Hsp70对CKII活性的影响多种研究结果提示Hsp70和DNA修复关系密切。Bases首先发现Hsp70能促进人白血病细胞对射线照射的修复,参与了氧化性损伤的碱基切除修复过程。而后有研究者报道Hsp70通过促进碱基切除修复过程中关键酶的活性,如APE和polyβ而促进修复。原核生物中的Hsp70,即DnaK也参与了核苷酸切除修复过程。在前一部分的结果中的酪蛋白激酶II(CKII),它是恢复阶段和Hsp70相互作用的重要蛋白。CKII本身是一种丝氨酸/苏氨酸激酶,可以通过磷酸化XRCC1、XRCC4和APE而促进氧化性损伤的修复,此外,CKII也和核苷酸切除修复途径的重要修复酶XPB有关。由于Hsp70和CKII在DNA修复方面都参与了NER和BER,在BER过程中有共同底物的APE,而我们上部分的结果发现两者在修复过程中是复合存在的。故在本部分中,运用免疫共沉淀和激光共聚焦技术对两者的交互作用进行深入研究,并用放射性自显影技术检测Hsp70是否对CKII的活性有影响。。Hsp70和CKII免疫共沉淀结果显示,在兔抗人Hsp70抗体沉淀下来的复合物中,有CKII的存在。逆向免疫共沉淀即在羊抗人CKII抗体沉淀下来的复合物中也检测到了Hsp70的存在。在16HBE细胞BaP染毒和不染毒时,我们得到了相同的结果。考虑到DNA修复是发生在细胞核内的,我们进一步用激光共聚焦技术来检测这两种蛋白质的位置关系,结果发现Hsp70和CKII在不染毒时主要分布在细胞浆,两者大部分重合。在BaP染毒后这两种蛋白均有一部分进入了细胞核,并且在某些位置明显重合。而测定不同Hsp70表达水平的细胞中的CKII活性结果显示高表达Hsp70细胞CKII活性比对照组增高(P<0.05)而低表达Hsp70细胞中CKII活性则降低。综上所述,本研究的结果如下:(1)确定了100μM的槲皮素为抑制16HBE细胞Hsp70表达的最佳剂量,采用含hsp70基因的cDNA重组质粒进行细胞转染并经筛选建立了稳定的Hsp70高表达细胞株。(2)Hsp70可以增强BaP、BPDE所致DNA损伤的修复。(3)在B(a)P染毒恢复阶段,Hsp70与维持DNA稳定、细胞结构和移动等多种功能的蛋白质结合存在。(4) Hsp70和修复密切相关的蛋白CKII在未染毒时在胞浆结合,染毒后均进入胞核并结合存在,并且高表达的Hsp70可以增强CKII的活性。本研究的创新之处在于:(1)同时使用了高表达和低表达Hsp70的细胞模型,为探讨Hsp70的功能提供有力的依据,可以从正反两个方面同时验证Hsp70的功能;(2)考虑到了Hsp70作为分子伴侣的性质,从对其底物的研究入手以阐述它在DNA修复中的具体作用。本课题有待深入研究的方面有:(1) Hsp70和CKII的相互关系尚需进一步研究,特别是Hsp70参与DNA修复的具体机制还有待深入的阐述;(2) DNA整体修复能力的测定如何应用于人群现场流行病学调查,如何应用于职业性有害因素对机体DNA损伤修复的评价,还需要进一步的探讨。