真核生物的细胞周期通过连续激活和失活特定的周期蛋白/周期蛋白依赖性激酶复合物活性进行调控。在哺乳动物细胞周期中，周期蛋白A和周期蛋白B通过泛素化降解途径使靶蛋白去磷酸化，促进有丝分裂中期向后期转化；周期蛋白D通过磷酸化Rb蛋白终止G1期，促进细胞G1/S期转化。　　不同的生物体包含的周期蛋白类型不同，单细胞真核生物纤毛虫表现出周期蛋白多样性，表明单细胞生物体内存在精细的调控机制。嗜热四膜虫含有1个小核和1个大核，小核为二倍体，在营养生长期转录沉默，大核为多倍体，转录活跃，营养充足时细胞进行无性生殖，饥饿条件下进行有性生殖。有性生殖过程中，小核进行减数分裂，产生4个原核，其中3个降解，另外1个原核进行有丝分裂产生配子核，配子核交换，融合产生合子核。合子核通过有丝分裂产生新的大核和新小核，完成有性生殖。嗜热四膜虫含有34种周期蛋白，其中Cyc2, Cyc17和Cyc28在四膜虫小核减数分裂期特异表达，Cyc2调控了小核减数分裂的起始，而Cyc17对减数分裂后期的起始和同源染色体的分离是必需的，但是Cyc28的功能目前并不清楚。　　本研究首次从嗜热四膜虫鉴定了有性生殖特异表达的周期蛋白基因CYC28，对其功能进行了分析，主要结果如下：　　1. CYC28生物信息学分析基于四膜虫大核基因组数据库（http//:www.ciliate.org）和功能基因组数据库(http://tfgd.ihb.ac.cn）分析表明嗜热四膜虫 CYC28（TTHERM_00082190）基因全长1174 bp，开放阅读框801 bp，预测编码266个氨基酸。RT-PCR产物测序分析表明CYC28序列正确。序列比对分析N端有一个由121个氨基酸组成的保守性周期蛋白框，周期蛋白框后有一个由9个氨基酸残基组成的破坏框。周期蛋白框同源序列分析表明Cyc28可能属于周期蛋白B3亚家族。Microarray表达谱和实时荧光定量检测结果表明CYC28在营养生殖期和饥饿期不表达，在有性生殖期特异表达，4 h时表达量最高。　　2. HA-Cyc28的细胞定位及表达分析为研究Cyc28的功能，构建带有HA标签的表达载体 pXS75-CYC28，该表达载体由MTT1启动子调控，在Cd2+诱导下高效表达，经基因枪转化，巴龙霉素浓度梯度筛选，选择稳定的细胞株。免疫荧光定位表明，Cyc28在有性生殖早期定位于细胞质，在8 h定位在凋亡的旧大核上，表明Cyc28可能通过泛素化途径，在凋亡的亲本大核中降解或者直接参与了亲本大核的凋亡。蛋白免疫印迹结果表明，HA-Cyc28在四膜虫有性生殖0 h没有表达，2 h后表达上调，在4h和8h蛋白条带变弱，可能部分发生泛素化降解，在16h配对分开后蛋白质消失。　　3.敲减CYC28对有性生殖进程无显著影响 CYC28是有性生殖期特异表达的基因，为进一步分析Cyc28在嗜热四膜虫有性生殖过程中的功能，我们首先构建了CYC28的敲除载体pNeo4-Δ-CYC28，转化不同交配型的四膜虫细胞，通过同源重组，筛选得到CYC28敲减细胞株。同野生型细胞相比，敲减株在有性生殖过程中，细胞配对，小核拉伸，小核减数分裂以及原核选择，合子核的有丝分裂都未见异常。由于未能获得CYC28完全敲除的突变体细胞株，进一步构建了CYC28的干扰质粒pCYC28hpCYH，该质粒由Cd2+调控表达。干扰质粒通过基因枪转化四膜虫，经放线菌酮抗性梯度筛选，获得不同交配型的突变体细胞株。qRT-PCR检测得到稳定的干扰株。观察四膜虫在有性生殖过程中核发育，结果表明小核发育过程未受影响，细胞配对，小核拉伸，减数分裂，配子核交换，新大核形成以及结合后的个体均正常，表明Cyc28的敲减对有性生殖的进程无显著影响。　　4.过表达Cyc28影响有性生殖期原核的有丝分裂在突变体细胞OE-CYC28-B和OE-CYC28-C配对后，CYC28基因的转录水平比野生型提高约10倍，观察有性生殖过程，过表达Cyc28引起原核有丝分裂进程的异常。同野生型相比，在有性生殖3.5h，45.5％细胞第一次减数分裂后期出现浓缩的染色体，未见染色体解聚后的小核；在4h，36.5%的细胞停留在第一次减数分裂后期，31.5%细胞进行的第二次减数分裂，小核松散；而在6h，大多数细胞选出的小核无法进行有丝分裂；在8h，45.3%细胞中未出现新大核，在12 h，未出现发育完成的两个大核一个小核的细胞。过量的外源Cyc28导致细胞核发育异常，原核有丝分裂受阻，有性生殖未能完成。　　本研究首次鉴定了嗜热四膜虫周期蛋白基因CYC28，实时荧光定量PCR表明CYC28在有性生殖期特异表达。敲减CYC28不影响细胞的发育，而过表达CYC28导致细胞有性生殖过程小核有丝分裂异常，暗示它的正常表达和降解对原核有丝分裂的完成是必需的。进一步获得CYC28的敲除株，有望揭示Cyc28在嗜热四膜虫生殖过程中具体功能，完善周期蛋白在纤毛类原生动物中的复杂调控机制。