柑橘果肉渣结合酚的模拟消化释放规律及抗炎活性评估

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柑橘汁为国内外柑橘加工产品的一大类,在柑橘汁加工过程中,会产生大量的果肉渣,因利用度低而造成柑橘资源的浪费。‘不知火’柑橘形状奇特、酸甜可口、水分充足,是我国畅销的柑橘品种,其果肉中含有大量的酚类物质,具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤等生理活性。酚类物质可分为游离酚与结合酚,因结合酚较难提取,因此其研究报道较少。本研究以‘不知火’柑橘果肉渣为试验原料,以结合酚为研究对象,利用响应面法分别优化碱、酸水解法的提取工艺;基于体外模拟胃肠道消化模型,测定‘不知火’柑橘果肉渣在模拟消化中的释放规律、抗氧化活性变化规律;通过LPS刺激RAW264.7细胞构建炎症模型,研究‘不知火’柑橘果肉渣游离酚、结合酚对炎症因子的影响。本研究旨在挖掘柑橘果肉渣及其结合酚的潜在价值,为其结合酚的生产、应用提供理论依据。主要研究结果如下:1.响应面法优化‘不知火’柑橘果肉渣中结合酚的碱法、酸法提取工艺最佳的碱法提取工艺参数:液料比为22 mL/g,NaOH溶液浓度为4.10 mol/L,碱解时间为3.20 h。在此工艺参数的基础上测得的碱解结合酚提取量为(356.51±5.02)mg/100 g。最佳的酸法提取工艺参数:液料比为42 mL/g,甲醇/硫酸(体积比)为15,酸解时间为15 h。在此工艺参数的基础上测得的酸解结合酚提取量为(220.09±3.90)mg/100 g;HPLC测定结果显示,游离酚中的黄酮总量较高,结合酚中的酚酸总量较高,且碱解结合酚中所含单体酚的种类及含量均比酸解结合酚多。2.‘不知火’柑橘果肉渣酚类物质在体外模拟消化模型中的释放规律(1)研究发现,胃酸、胃蛋白酶、胰酶、胆盐既能不同程度地促进‘不知火’柑橘全果肉、果肉渣中酚类物质的释放,也能破坏酚类物质的结构。在模拟胃消化中,酚释放量与黄酮释放量均有不同程度的增加(全果肉的酚及黄酮释放量分别是胃消化0h时的1.39倍、2.31倍,果肉渣的酚及黄酮释放量分别是胃消化0h时的2.31倍、2.23倍)。果肉渣中酚类物质释放量增量是全果肉的74.58%,说明果肉渣中仍有大量可利用的酚类物质。在模拟肠消化中,胰酶和胆盐虽然促进了酚类物质的释放,但由于肠道的碱性环境以及胰酶的降解作用,导致酚释放量先略有增加然后减少。最终全果肉的酚及黄酮释放量降幅为2.92%、2.35%,果肉渣的酚及黄酮释放量降幅为12.96%、15.47%。(2)胃肠消化环境pH、消化酶种类、酚类物质的组成等因素均可影响抗氧化活性。模拟胃消化结束后,‘不知火’柑橘全果肉、果肉渣的DPPH·自由基清除能力提升了 0.4倍、1.2倍,ABTS·自由基清除能力提升了 0.44倍、0.95倍;模拟肠消化结束后,‘不知火’柑橘全果肉、果肉渣的DPPH·自由基清除能力的降幅为1.4%、5.32%,‘不知火’柑橘全果肉ABTS·自由基清除能力的增幅为7.08%,果肉渣的降幅为5.88%。3.‘不知火’柑橘果肉渣游离酚、结合酚对巨噬细胞炎症因子的影响(1)MTT试验结果表明0~60 μg/mL的游离酚、结合酚无明显细胞毒性,0~1μg/mL的LPS无明显细胞毒性,且不会造成细胞增殖,选择1 μg/mL的LPS诱导RAW264.7细胞产生炎症构建研究模型。LPS处理组的巨噬细胞形状扁长、长伪足、细胞间隔较大,经游离酚、结合酚处理的细胞逐渐接近于正常形态。(2)0~60 μg/mL范围内,不同浓度的游离酚、结合酚均对RAW264.7细胞中NO分泌有不同程度的抑制效果,且抑制强度有剂量依赖性;游离酚、结合酚均是在共作用模式下的抑制效果较好;游离酚、结合酚在6 h、12 h、24 h、48 h均可抑制NO分泌,但低浓度组中游离酚作用6 h、结合酚作用48 h时的抑制效果不佳。(3)低(5 μg/mL)、中(20 μg/mL)、高(60 μg/mL)浓度组的游离酚、结合酚均能有效抑制TNF-α、IL-1β、IL-6细胞因子的分泌及mRNA的转录。高作用剂量下,游离酚组的TNF-α、IL-1β蛋白浓度较低,结合酚组的IL-6蛋白浓度较低;中、低作用剂量下则相反,结合酚组的TNF-α、IL-1β蛋白浓度较低,游离酚组的IL-6蛋白浓度较低。游离酚高浓度组对TNF-α mRNA转录的抑制作用略强于结合酚高浓度组,结合酚低浓度组对TNF-α mRNA转录的抑制作用略强于游离酚低浓度组。游离酚对IL-1β mRNA表达的抑制作用强于同剂量的结合酚。结合酚对IL-6 mRNA表达的抑制作用略强于同剂量的游离酚。
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