【摘 要】
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Gd X和p15RS基因的异常表达在某些疾病尤其是自身免疫性疾病的发生、发展中起到重要的作用,基于当前国内外针对Gd X和p15RS基因及其单克隆抗体的研究与应用尚未十分普遍,而单
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Gd X和p15RS基因的异常表达在某些疾病尤其是自身免疫性疾病的发生、发展中起到重要的作用,基于当前国内外针对Gd X和p15RS基因及其单克隆抗体的研究与应用尚未十分普遍,而单克隆抗体已成为重要的研究工具和治疗手段,如何制备出性能较高的Gd X和p15RS单克隆抗体,并将其推广应用已经成为当前关于Gd X和p15RS基因研究的热点话题和主要趋势。本文选取了两种典型的基因Gd X和p15RS,研究了蛋白的真核表达和单克隆抗体的制备,并对制备出的Gd X和p15RS单克隆抗体进行性能的鉴定。在制备过程中,Gd X和p15RS基因已经分别插入到p EFneo-flag/h和pc DNA3.1-Myc载体内以建立高分泌的表达系统,经转染HEK293T细胞,通过纯化获得符合免疫要求的抗原,进而免疫BALB/C小鼠,血清效价通过间接ELISA法测得,采用杂交瘤技术制备筛选及克隆培养,制备出具有目的基因的单克隆抗体,获得了高特异性和亲和力的抗Gd X和p15RS蛋白的单克隆抗体,具体结果如下:(1)使用E.coli DH5α通过Ca Cl2法扩增获得的质粒A260/280可达到1.8左右,获得高纯度适合细胞蛋白表达级的质粒;使用HEK293T高分泌细胞表达系和Lipofecter2000脂质体转染试剂通过对细胞生长条件和转染条件的摸索,制备出的细胞株具有高稳定性和增殖活力;经由非变性SDS-PAGE、Western blot及层析浓缩,制备出浓度分别为2.28 mg/ml和1.71 mg/ml的Gd X和p15RS蛋白。(2)使用制备的DNA和蛋白质免疫BALB/C小鼠,测得血清均可达105以上,选取P/N值大于2的小鼠脾细胞,通过PEG诱导作用进行细胞融合,通过筛选及扩大培养,制备出2株Gd X杂交瘤细胞株1-B2和4-D3及2株p15RS杂交瘤细胞株2-C8和5-H11,经鉴定均只分别于Gd X和p15RS蛋白反应,具有较强特异性,抗体纯度可达95%以上,四株单抗的相对亲和常数均达到1.0mol/L以上。本文初步的研究了Gd X和p15RS基因,成功的制备出抗Gd X和p15RS蛋白的单克隆抗体,且二者具有稳定的生物学特性,为更好地研究Gd X和p15RS基因及应用其抗体提供理论依据并奠定基础。
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