自然杀伤细胞(Nature Killer cell,NK细胞)最初被称为大颗粒淋巴细胞,其表面表达多种不同于T细胞抗原受体(TCR)与B细胞抗原受体(BCR)的非抗原特异性受体,因不需要抗原存在或预先致敏就能够识别并杀伤一些肿瘤细胞而得名。作为固有免疫系统中的重要一员,NK细胞在机体抵御外界感染,防止体内细胞恶性转化等方面发挥着重要的作用。此外,NK细胞还能通过分泌多种细胞因子和趋化因子,如IFN-γ、TNF-α/β、IL-2、IL-10、IL-13、CCL2 (MCP-1)、CCL3 (MIP1-a)、CCL4(MIP1-b)、CCL5(RANTES)、XCL1(lymphotactin)和CXCL8(IL-8)等,以及通过细胞间的接触在免疫调节中扮演重要角色。NK细胞与病毒感染和癌症之间的关系一直是免疫学研究的热点领域,近年来更有研究发现NK细胞在糖尿病,脑脊髓炎,多发性硬化症,系统性红斑狼疮等多种自身免疫性疾病的发生发展中扮演了保护机体或促进疾病的复杂的双重角色。系统性红斑狼疮(Systemic Lupus Erythematosus,SLE)是一种慢性的能引起机体多种脏器病变的自身免疫性疾病,多发病于女性,尤其是育龄期的女性。尽管目前对SLE发病机制的研究得到较大的发展,但其成果主要集中在疾病与适应性免疫系统的关系上,而固有免疫系统特别是NK细胞对疾病的影响目前尚不清楚。越来越多的证据表明,固有免疫系统在自身免疫病的发生发展过程中起到了重要作用。对于大多数自身免疫病患者来说,固有免疫系统和适应性免疫系统之间的相互作用可能是一个较长的过程,在疾病静息期很难被发现,固有免疫系统在疾病早期发挥的作用也可能因此被忽视。基于上述几点考虑,本研究目的在于研究NK细胞在SLE疾病进展中的作用机制,重点探讨了SLE患者外周中NK细胞数量显著降低的原因,并比较了外周循环和局部组织中的NK细胞的功能差异,以期为寻找更好的SLE临床诊断和治疗方案提供线索。在本实验中,我们收集SLE患者的外周血标本,根据疾病状态并按照SLEDAI(SLE Disease Activity Index)评分标准将患者分为活动期(SLEDAI≧4分)和缓解期(SLEDAI﹤4分)两组,以健康成年人的外周血作为对照。采用流式细胞术检测不同淋巴细胞群体的表型,分析各种细胞所占比例,再结合细胞计数算出这些细胞群体的具体数量;同时采用流式细胞术检测NK细胞表面多种活化性及抑制性受体的表达情况;用密度梯度离心的方法分离出外周血中的单个核淋巴细胞,再利用MACS磁珠分离方法纯化出特定的细胞亚群,分别加入细胞因子或SLE病人血浆进行体外培养;流式细胞术检测细胞在不同刺激因素作用下的状态变化;利用Annexin V和PI染色分析体外培养的细胞亚群在刺激因素作用下的凋亡情况;利用ELISA方法检测血浆中特定细胞因子的表达水平,用胞内细胞因子染色技术检测细胞分泌特定细胞因子的能力;利用荧光定量PCR技术检测干扰素诱导基因的表达情况;采用H&E染色方法观察组织病理损伤状况。通过上述研究方法,我们获得了以下结果以及结论:1.活动期SLE患者外周循环中CD226~+ NK细胞的比例明显降低首先我们对SLE患者外周血中CD4+ T、CD8+ T、B、NK、NKT、MDC和PDC细胞的比例进行检测,发现活动期狼疮患者NK和NKT细胞的比例显著低于正常对照和缓解期的狼疮患者。再结合细胞计数算出单位毫升血中NK和NKT细胞的绝对数,发现活动期患者NK和NKT细胞的绝对数也显著降低。分析NK细胞表面分子的表达发现,活化性分子CD69、NKp46、NKG2C、NKG2D、CD16和抑制性分子NKG2A、CD94和CD85j的表达在活动期患者和正常对照NK细胞的表达没有明显差异,但是活化性CD226受体的表达在活动期患者NK细胞明显降低。为了验证这一现象,我们在小鼠模型中也进行了CD226表达的检测,同样发现狼疮发病小鼠脾脏中NK细胞上CD226表达明显低于对照鼠和发病早期的小鼠。综上所述,外周循环的NK细胞比例和数量在活动期狼疮患者体内明显降低,却能在缓解期患者体内基本恢复到正常水平,同时在活动期狼疮患者体内降低的NK细胞主要是CD226~+ NK细胞。2. CD226~+ NK细胞在SLE患者体内随疾病状态的改变出现动态变化对15例临床患者进行治疗期间的动态观察,分别获取药物治疗前以及治疗期间不同天数的外周血,检测NK细胞比例和CD226分子在NK细胞上表达变化情况。结果发现其中有6例患者病情没有得到有效缓解,他们的NK细胞比例和CD226分子的表达持续降低,与之相反的另外9例患者病情好转,其NK细胞比例和CD226分子的表达明显恢复。综上所述,CD226~+ NK细胞的比例在狼疮患者体内随病情状态的改变而动态变化,说明CD226~+ NK细胞可能参与了疾病的进程。3. SLE患者树突状细胞上表达CD226分子的配体CD112和CD155比较分析CD226的配体CD112和CD155在T、B、NK、MDC和PDC细胞上的表达,结果发现SLE患者的PDCs上同时表达这两种分子,并且表达量略高于正常对照。根据以上结果我们推测在SLE患者体内NK细胞和PDCs很可能通过CD226-CD112/CD155这对受配体的识别而产生相互作用,参与狼疮的发病过程。4. IFN-α诱导CD226~+ NK细胞发生活化后凋亡首先利用ELISA的方法检测患者血浆中IFN-α, IFN-α, IL-2和IL-12等细胞因子的含量,结果只检测出IFN-α的水平明显升高。随后对5例患者的血浆进行连续动态观察,发现IFN-α的表达水平随疾病缓解持续降低,病情稳定后基本恢复至正常人水平。用患者血浆刺激正常人的外周血单个核细胞(PBMCs),培养24小时后检测干扰素诱导基因(IFIGs)表达,通过与阻断IFN-α的对照组相比较发现,患者体内IFN-α能够诱导正常细胞表达高水平IFIGs,说明这些IFN-α具有良好的生物学活性。流式结果显示PDCs是SLE患者体内IFN-α的主要来源细胞。利用体外rhIFN-α或患者血浆培养正常人PBMCs发现,CD226~+ NK细胞能被诱导高表达CD69,而CD226~- NK细胞活化不明显。同时,伴随活化的过程,NK细胞出现明显的CD226表达降低及活化诱导的凋亡发生。综上所述,在活动期狼疮患者体内PDCs持续产生IFN-α使IFN-α水平升高,而这些IFN-α能够刺激NK细胞发生活化诱导的细胞凋亡,并且主要影响的是CD226~+ NK细胞,最终导致患者外周中整体NK细胞数量降低。5.活化的CD226~+ NK细胞介导MRL/lpr小鼠肾脏损伤参与SLE疾病进展将MRL/lpr狼疮模型鼠分成发病早期和已发病两组,以MRL/mp鼠作为正常对照,分别研究小鼠脾脏和肾脏中NK细胞比例和数量的变化,结果发现发病早期小鼠肾脏中有大量CD226~+ NK细胞浸润,并且浸润的细胞明显处于活化状态。通过检测胞内细胞因子的表达,发现肾脏浸润的NK细胞比脾脏中的NK细胞表达高水平的IFN-α、颗粒酶B和穿孔素。根据以上结果我们发现在狼疮疾病中,外周活化的CD226~+ NK细胞在发生凋亡前会浸润到肾脏等组织中,通过分泌IFN-α、细胞毒性颗粒等在一定程度上参与了组织的病理损伤。综合以上,本研究得到如下结论:SLE患者NK细胞在体内高水平IFN-α的作用下发生活化诱导的细胞凋亡现象,导致外周NK细胞的数量显著降低,并且主要受影响的是CD226~+ NK细胞;活化的CD226~+ NK细胞浸润到局部组织中,通过释放免疫调节因子和细胞毒性颗粒造成组织损伤,参与了狼疮的疾病进程。