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目的:
本实验制备发酵支原体(Mycoplasma fermentans,Mf)、梨支原体(Mycoplasma pirum,Mpi)致死性感染免疫缺陷大鼠模型,探讨其所致免疫缺陷大鼠快速死亡、多器官损伤以及血清细胞因子变化的相关性,从而为免疫缺陷患者合并Mf和Mpi感染的临床治疗提供理论与实验依据。
方法:
对数生长期Mf、Mpi经腹腔感染免疫缺陷大鼠和非免疫缺陷大鼠,计算致死率,观察心、肝、肺、肾和脑等重要器官超微结构改变以及比较大鼠血清细胞因子变化,并分析它们之间的相关性。
1.培养基
改良的SP4(用于Mpe、Mpi、Mf以及W12等支原体的分离培养)液体和固体培养基。
2.标准菌株来源
已知标准对照菌株Mf、Mpi和穿通支原体(Mycoplasma penetrans,Mpe)分别由东南大学医学院流行病学教研室赵季文教授惠赠,而W12为本实验室穿通支原体分离株。
3.实验动物与分组
3.1免疫缺陷大鼠模型的制备:隔日腹腔注射环磷酰胺,3次制成免疫缺陷模型。
3.2感染大鼠模型制备
3.2.1实验组
免疫缺陷大鼠随机分为4组(Mf、Mpi、Mpe及W12感染免疫缺陷组),腹腔注射对数生长期相应支原体菌液。
3.2.2对照组
免疫缺陷和正常大鼠分3组(NS免疫缺陷组、NS正常大鼠组及Mf感染正常大鼠组),腹腔注射等剂量NS和Mf菌液。
4.大鼠血液及组织支原体的再培养
各组大鼠均进行血液的普通培养以排除血液其他细菌的感染,以及心、肝、肺、肾和脑组织支原体再培养。
5.各组大鼠观察及致死率比较
6.血清细胞因子检测
各组心脏无菌采血分离血清,采用ELISA法检测大鼠血清IL-10、TNF-α、IL-1β并IL-6,比较组间差异。
7.电镜标本的制作与观察
分别取死亡组大鼠的心、肝、肺、肾和脑等重要脏器组织经2.5%戊二醛和1%锇酸双重固定,丙酮梯度脱水,Epon-812环氧树脂包埋,RMC-PT超薄切片机切片,半薄切片光镜定位于组织实质细胞部分,超薄切片经铅-铀双重染色,H-7500透射电镜下观察,拍片。
8.统计学分析
采用SPSS13.0软件对测量数据进行单因素方差分析和Fisher确切概率法进行数据处理。
结果:
1.大鼠血液及组织脏器支原体再培养结果
各支原体感染组及Mf感染的正常大鼠血液及组织中均各自分离到相应的支原体,NS组大鼠均未分离到上述支原体。
2.大鼠感染致死结果
Mf免疫缺陷和Mpi免疫缺陷组死亡率均为100%(12/12),与NS组0%(0/7)和Mf正常大鼠28.6%(2/7)分别比较其差异均具有统计学意义(P<0.01)。
3.血清细胞因子检测比较
(1)免疫缺陷感染组(Mf、Mpe、W12)大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10的含量明显高于NS免疫缺陷组(P<0.01)。
(2)免疫缺陷感染组(Mf、Mpi、Mpe、W12)大鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-6的含量均明显低于Mf感染正常大鼠组(P<0.01),而IL-10的含量明显高于Mf感染正常大鼠组(P<0.01)。
(3)Mf感染正常大鼠组血清TNF-α、L-1β和IL-6的含量明显高于NS正常大鼠组(P<0.01),而IL-10的含量明显低于NS正常大鼠组(P<0.01)。
4.心、肝、肺、肾和脑超微结果改变
支原体感染免疫缺陷组大鼠死亡后各脏器均出现相应的病理改变,呈现多种器官的严重损害,表现为心肌纤维不同程度的溶解;肝脏炎性反应明显、肝细胞线粒体结构破坏;肺泡空泡样改变、炎性细胞浸润;肾小管上皮细胞破坏、核固缩;脑组织细胞大面积水肿等,而Mf感染正常大鼠组器官超微结构病变则较轻。
结论:
1.Mf、Mpi可引起免疫缺陷大鼠多器官损伤以及高致死率,其致病性与机体免疫系统状态有着一定的相关性。免疫缺陷可以增加支原体的易感性。
2.Mf,Mpi感染后炎症过程中TNF-α、IL-1β和IL-6等前炎症因子的过度释放,是导致免疫缺陷大鼠全身多种器官损害的重要原因。
3.前炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6和其拮抗因子IL-10的平衡失调,是导致Mf、Mpi感染免疫缺陷大鼠多器官损伤以至快速致死的重要因素。