前言：　　喉癌是头颈部常见癌症之一，喉癌的预后给患者带来了极大的痛苦。喉鳞状细胞癌是一种最常见的喉癌类型，极易发生颈部的淋巴结转移。研究报道，干细胞转录因子SOX2的表达异常参与多种恶性肿瘤的发生与发展进程。在对喉癌患者的喉癌组织研究中证实SOX2的高表达促进喉癌的发生和发展进程，但目前SOX2在该过程中发生作用的具体分子机制仍然不清楚，有待于进一步深入研究。　　基于癌细胞无限增殖、转化和转移的特点，给癌症的治愈带来很大的难度。肿瘤的转移是引起肿瘤的发病率和死亡率重要原因。研究证明SOX2参与多种肿瘤细胞的侵袭和转移，但却发挥双重作用。在胃癌和肺癌的研究中发现，SOX2的高表达降低了两种癌细胞的侵袭和转移能力;然而在乳腺癌和肝内胆管细胞癌中，SOX2的高表达却发挥了相反的作用。目前还未见高表达SOX2对喉鳞状细胞癌Hep-2细胞迁移和侵袭能力的影响的报道。研究证实MMP-2在肿瘤转移中发挥作用，高表达SOX2后是否会影响MMP-2的表达和活性，进而影响喉癌细胞的转移，仍需进一步研究以阐明高表达SOX2对喉癌细胞增殖和迁移的作用机制。　　研究表明，PI3K/AKT信号通路参与人类恶性肿瘤的发生发展，该通路与肿瘤的增殖、凋亡、转移和侵袭等多个细胞过程有关。PI3K-AKT信号通路成为鼻咽癌、胰腺癌、甲状腺癌、肺癌、胃癌、膀胱癌和乳腺癌等多种癌症治疗的靶点。研究表明PI3K/AKT信号通路的异常活化与喉鳞癌的发生有关。在人前列腺癌细胞的研究中发现PI3K/AKT信号通路参与SOX2的表达。而且研究发现有药物可以通过PI3K/AKT途径抑制Hep-2细胞增殖并诱导其凋亡。但在Hep-2细胞中，SOX2是否通过PI3K/AKT途径介导细胞的增殖和迁移，未见报道。　　本实验分为三部分，首先通过分子生物学手段构建重组质粒pEGFP-N1-SOX2，通过脂质体2000将重组质粒转染到喉癌细胞Hep-2中，构建SOX2基因稳定转染细胞株，为研究SOX2基因在喉癌中的作用建立良好的实验平台。然后对Hep-2细胞过表达SOX2对细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响进行研究。同时检测了喉癌细胞SOX2过表达后对MMP-2的表达和活性影响，并通过siRNA干扰下调MMP-2表达和MMP-2抗体处理SOX2过表达Hep-2细胞，进一步验证了MMP-2与细胞迁移和侵袭能力的关系，明确了SOX2高表达促进细胞迁移和侵袭的作用机制。最后，用PI3K/Akt特异性抑制剂LY294002处理SOX2过表达细胞，检测SOX2过表达对Akt，p-Akt，mTOR和p-mTOR在细胞中表达的影响，Transwell检测细胞侵袭能力的变化。最终明确SOX2在喉癌细胞Hep-2中是否通过PI3K/Akt信号通路促进细胞的迁移和侵袭，为治疗和预防喉癌的转移和侵袭发现了新的靶点，并提供理论依据。　　一、SOX2基因稳定转染喉癌细胞株(Hep-2)的建立　　目的：构建重组质粒pEGFP-N1-SOX2，脂质体转染法构建SOX2过表达稳转Hep-2细胞系，为研究SOX2在喉癌发生的机制及信号通路研究构建良好的实验平台。方法：PCR进行SOX2基因扩增，TA克隆和测序后获得SOX2基因片段，双酶切、连接和转化后，挑取白色单菌落进行PCR菌落初步鉴定，用酶切反应进一步鉴定，最终通过测序确定重组质粒pEGFP-N1-SOX2构建正确。调整Hep-2细胞状态，通过脂质体2000将质粒转染到Hep-2中，实验分为细胞分为空白对照组(Hep-2)、空载体对照组(vector)和SOX2过表达组(SOX2)。使用600 g/mlG418的DMEM完全培养基进行单克隆细胞株的筛选。筛选后的单克隆细胞置于37℃、5％CO2、饱和湿度条件下中进行培养，用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达情况，初步鉴定SOX2过表达稳转Hep-2细胞系是否构建成功。通过Real-time PCR、Western blot和免疫荧光实验从不同角度共同验证各组细胞SOX2的表达情况。结果：成功的构建了重组表达载体pEGFP-N1-SOX2。质粒转染后在荧光显微镜下观察到绿色荧光蛋白的表达。通过Real-time PCR、Western blot和免疫荧光实验检测结果显示，对照Hep-2组，vector组细胞SOX2表达与前者表达变化不大，SOX2组细胞SOX2在mRNA和蛋白水平显著表达(p＜0.01)。结论：成功的构建了过表达SOX2基因稳定转染喉癌Hep-2细胞株。　　二、过表达SOX2对喉癌细胞增殖、侵袭和转移能力的影响　　目的：研究SOX2过表达后，细胞的增殖、迁移和侵袭能力的变化以及对侵袭转移相关蛋白MMP-2的表达和活性的影响，明确过表达SOX2影响细胞增殖和迁移能力的机制。方法：质粒转染细胞，实验分为空白对照组（Hep-2）、空载体对照组(vector)和SOX2过表达组(SOX2)。克隆形成实验检测各组细胞克隆形成率，MTT实验检测各组细胞增殖情况，Western blot检测增殖相关蛋白PCNA和Cyclin D1的表达。通过划痕实验检测各组细胞的迁移能力，Transwell实验检测各组细胞的侵袭能力。Real-time PCR和Western blot检测各组细胞MMP-2的表达，明胶酶谱法检测各组细胞MMP-2的活性。通过siRNA使SOX2过表达细胞MMP-2的表达下调，实验分为空白对照组(SOX2)、阴性对照组(control siRNA)和MMP-2沉默组(MMP-2 siRNA)。Western blot检测各组细胞MMP-2的表达，划痕实验检测细胞的迁移能力，Transwell实验细胞的侵袭能力。利用0.1μg/mlanti-MMP-2抗体和IgG抗体处理SOX2过表达细胞，实验分为空白对照组(SOX2)、IgG对照组(IgG)和anti-MMP-2组(anti-MMP-2)。划痕实验检测药物处理各组细胞12h和24 h的迁移能力，Transwell实验检测药物作用各组细胞24 h的侵袭能力。结果：质粒转染细胞后，与Hep-2组相比，SOX2组细胞克隆形成率、细胞增殖率、PCNA和Cyclin D1的表达水平、细胞迁移率和细胞侵袭个数显著提高(P＜0.01)，而vector组与对照组各指标差异不大。相对Hep-2组，SOX2过表达后通过Real-time PCR和Western blot检测细胞中MMP-2的表达水平显著上调（P＜0.01），明胶酶谱法发现MMP-2的活性显著提高（P＜0.01）。无论是RNAi使过表达SOX2细胞中MMP-2表达下调还是使用anti-MMP-2处理SOX2过表达细胞，相对于SOX2组，细胞的迁移和侵袭能力均下调。结论：SOX2过表达后促进Hep-2细胞的增殖、迁移和侵袭能力，同时伴随着MMP-2表达的上调和活性的增加。揭示SOX2可能通过介导MMP-2的表达影响细胞的迁移和侵袭能力。　　三、过表达SOX2对喉癌细胞中PI3K-Akt信号通路的影响　　目的：通过Western blot检测PI3K/AKT信号通路特异性抑制剂LY294002处理pEGFP-N1-SOX2细胞后Akt，p-Akt，mTOR和p-mTOR的表达情况，Transwell检测LY294002处理后对SOX2过表达细胞的侵袭能力的影响，明确Hep-2细胞SOX2过表达后是否介导PI3K-AKT信号通路促进细胞恶性表型的发生。方法：用20μM的LY294002和DMSO分别处理pEGFP-N1-vector和pEGFP-N1-SOX2两组细胞，处理30 min后，收集细胞用于transwell和western blot的检测。实验分为:vector+DMSO组、SOX2+DMSO组、vector+LY294002组和SOX2+LY294002组。Western blot检测各组细胞Akt，p-Akt，mTOR和p-mTOR蛋白的表达，Transwell实验检测各组细胞的侵袭能力。结果：LY294002处理细胞后，无论是对于转染空载体的细胞还是SOX2稳定表达的细胞，p-Akt和p-mTOR蛋白较LY294002处理前表达下调，而Akt和mTOR在LY294002处理前后几乎没有发生变化。与SOX2+DMSO组相比，LY294002处理SOX2过表达细胞后，细胞的侵袭能力显著下降（P＜0.01）。结论：SOX2过表达后，p-Akt和p-mTOR蛋白表达上调。抑制PI3K-AKT信号通路后，SOX2引起的p-Akt和p-mTOR表达上调作用被减弱，同时SOX2促进细胞侵袭的能力明显受到阻碍。过表达SOX2可能通过PI3K-AKT信号通路促进Hep-2迁移和侵袭的发生。