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肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一,具有高发病率、高死亡率等特征,对其治疗目前以传统手术切除、放化疗为主,但生存率没有明显提高,这可能与肝癌的恶性增殖及远处转移密切相关。随着细胞分子生物学的发展,基因治疗作为一种新的研究手段在肝癌诊断、治疗及预后方面的优越性逐渐显现。其中,被SCIENCE杂志评为2002年度10大重要突破之首的强有力的基因沉默工具——RNA干扰(RNA inteference RNAi),是一项在基因功能研究和基因治疗研究中拥有巨大应用潜力的新技术,其机制是双链RNA(double stranded RNA,dsRNA)介导序列特异性转录后基因沉默。因此,发掘肝细胞恶性转化过程相关基因及其功能、探究肝癌发生、发展机理将有助于突破肿瘤当前治疗的瓶颈。细胞恶性转化相关基因——膜连蛋白A2(ANXA2),其异常表达与人类多种类型肿瘤细胞的恶性增殖、浸润及转移相关,资料显示其在肝癌细胞中表达量有所升高,可作为肝癌血.清标志物,本文采用已优化转染条件的磷酸钙法,将针对人ANXA2的siRNA重组质粒导入人肝癌细胞SMMC-7721并观察对靶基因表达及细胞生物学行为的影响。本实验为肝癌的实验性基因治疗研究积累了资料。方法1.根据GenBank数据库提供的人ANXA2基因各变异体mRNA序列,优化设计出可针对各变异体的四条靶向ANXA2的干扰序列,合成这些序列并克隆至载体pU6H1-GFP,人细胞基因组错义对照序列(SCR)亦克隆至载体pU6H1-GFP。2.优化磷酸钙转染肝癌细胞相关参数,分组：正常组(NC)、四个干扰组(siA2-1、siA2、siA2-3及siA2-4)及错义对照组(siRNASCR),以优化了转染条件的磷酸钙法将重组子导入人肝癌细胞SMMC-7721。3.以半定量RT-PCR和western blotting检测转染后不同时间(24hrs、48hrs、72hrs和96hrs)ANXA2mRNA及蛋白表达变化。4.以MTT法、Hoechast33258染色及体外损伤修复实验等分析抑制ANXA2表达后对SMMC-7721细胞增殖、凋亡形态学及体外运动能力的影响。结果1.酶切鉴定及DNA测序证实外源siRNA片段准确插入pU6H1-GFP载体,重组子构建成功。2.优化了磷酸钙转染条件,结果显示：转染前细胞50%-60%汇合率、8μg质粒用量(直径30mm培养皿)、20mins-30mins沉淀形成时间及6hrs孵育时间转染效率较高；细胞传代次数及抗生素有无对转染效率影响不显著,但血清在本实验条件下是必不可少的。3.半定量RT-PCR和western blotting结果显示：转染24hrs至96hrs后,所设计的四条siRNA序列均不同程度抑制了ANXA2的表达(p<0.05),且呈时间依赖性,转染72hrs后mRNA表达抑制率最高,转染72hrs至96hrs后蛋白表达抑制程度最高：其中1号、2号靶点敲低效应更为显著：免疫细胞化学实验再次证明了上述结果的合理性：siRNAscR组与正常组基因表达差异不显著(p>0.05)。4. MTT、Hochast33258染色及体外损伤修复实验结果提示,pU6H1-GFP-siANXA2转染SMMC-7721细胞后,细胞体外增殖及运动能力被显著抑制(p<0.05),其抑制效应与ANXA2表达敲低程度呈正相关,转染72hrs、96hrs后抑制效应更为显著(p<0.01),细胞显现典型的凋亡形态学特征；siRNAscR组增殖、凋亡及运动能力与正常组差异均不显著(p<0.05)。结论ANXA2的高表达水平与肝癌细胞的增殖、凋亡及运动能力密切相关,以RNAi方法抑制该基因的表达可以有效地抑制肝癌细胞的恶性生物学行为。ANXA2有望成为肝癌基因治疗的靶点,质粒载体pU6H1-GFP有可能作为安全有效的基因治疗载体,本实验为肝癌的实验性基因治疗研究提供了资料依据。