两个缺铁响应拟南芥突变体的筛选及鉴定

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土壤作为农业生产最基本的条件和基础,是农业资源的重要组成部分,也是作物生长的营养库。而铁作为动植物生长需求量最大的微量营养元素,在动、植物生命活动中起着非常重要的作用。土壤中的铁是植物体铁元素的主要来源,而铁在地壳中的含量虽然丰富,但有效性却较低,特别是石灰性土壤中,铁多以Fe3+的形式被固定而难以被植物所吸收,这就导致作物常因缺铁失绿而生长不良,影响农作物产量、品质及人类膳食健康。研究植物体内铁吸收、利用的调控机制对于促进植物高效利用土壤中的铁元素,培育铁高效作物品种具有重要的指导作用。本研究中,选取了拟南芥中两个早期强烈响应缺铁信号的基因CYP82C4(At4g31940)和Nig1(New Intresting Gene1,At1g47400),以二者的基因表达变化作为拟南芥响应缺铁的信号标记,进而筛选其他可能参与植物铁稳态分子调控的基因成员。通过从基因组DNA中分别分离出以上两个基因的启动子并连接荧光素酶报告基因LUC2并分别转化拟南芥野生型株系Col-0,进一步通过T-DNA随机插入方法获得一个突变体库。在突变体筛选过程中,得到一个强烈响应缺铁信号的突变体L22-8和一个抑制缺铁信号响应的突变体L128。  突变体L22-8是经ProCYP82C4∷LUC2转化拟南芥野生型株系并通过抗性筛选得到的单拷贝纯合株系。和野生型相比,正常情况下L22-8地上部和地下部内源CYP82C4的表达量均显著增高,缺铁处理时其地上部表达量仍高于野生型,而地下部则不明显。基因表达定量结果显示FIT,bHLH38和bHLH39等植物铁代谢关键调控因子的表达发生了显著变化,但植株总铁、磷、锌的含量和根长的表型较野生型并没有显著区别,表明该T-DNA的插入虽影响了植株对缺铁胁迫的响应,但并不直接作用于植株对铁的吸收、转运上。反向PCR分析发现L22-8的T-DNA插入位点位于At3g51950和At3g51960之间,且这两个基因的转录表达在正常生长条件下均略低于Col-0。基因互补实验发现仅有At3g51960能部分互补L22-8的荧光信号,表明At3g51960基因的表达影响了CYP82C4对缺铁胁迫的响应。  突变体L128是在带有ProNig1∷LUC2的单拷贝纯合株系Nig22-1的基础上,经T-DNA随机插入突变获得的单拷贝纯合株系。和母本Nig22-1相比,无论是正常情况下还是缺铁处理条件下内源基因Nig1在地下部的表达量均显著降低。基因表达定量结果显示,缺铁响应的Marker基因FIT、FRO2和IRT1的表达均表现为正常情况下表达升高,而缺铁处理下表达反而降低现象,表明由于T-DNA的插入,可能影响了Nig1基因的表达,使得正常生长情况下,植株就表现出对缺铁信号的响应;而当植株处于缺铁环境中时,由于Nig1基因响应表达受阻,导致植株对缺铁信号的转导受阻,影响了缺铁响应相关基因的诱导。说明Nig1基因及其所在的调控通路在铁吸收及缺铁信号传导方面具有重要的作用。此外与母本Nig22-1相比,在正常生长条件下突变体L128表现出根长较短,叶绿素含量较低,植株较小,莲座叶少、抽薹较早等现象;缺铁处理下则根长表型更为明显,且根部铁还原酶活性降低。表明可能由于T-DNA插入,影响了植株的正常生长、发育。但L128植株地上部和种子中总铁、锌、锰的含量并没有明显差异,说明突变体L128并没有影响到植株铁元素的总含量,可能仅影响到对有效铁的吸收、利用。  本研究通过对突变体进行筛选和鉴定,探索了拟南芥基因组中可能存在的新的转录因子,进一步充实了缺铁响应分子调控网络,为今后该方面研究工作的开展奠定了良好的材料基础和方法指导,同时也为铁高效分子育种工作提供了新思路,为改良作物品质、开发作物高效利用养分的潜力等工作发掘了进一步的理论依据。
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