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狂犬病（Rabies）是人畜共患的神经系统传染病,由狂犬病病毒（Rabies virus,RABV）引起,每年造成超过59,000人死亡。狂犬病发病后致死率几乎为100%,当前尚无针对狂犬病的治疗方法和药物,防止狂犬病的发生与传播的最有效的方法依然是接种疫苗。病毒样囊泡（Virus-like vesicles,VLVs）是一种具有感染性的、可自我增殖的、有囊膜包裹的类病毒毒株,仅由塞姆利基森林病毒（Semliki forest virus,SFV）复制酶和水泡性口炎病毒糖蛋白（Vesicular stomatitis virus glycoprotein,VSV-G）组成,其感染细胞的机制至今仍不明确。由SFV复制酶和狂犬病病毒糖蛋白（Rabies virus glycoprotein,RABV-G）组成的VLVs在细胞中增殖的滴度相对较低,阻碍了其作为狂犬病疫苗的应用。进一步研究发现,VLVs在BHK-21细胞上连续传代50次后,复制酶上的10个氨基酸突变（G-106-E、V-351-I、L-481-S、I-516-T、D-555-G、A-1151-T、M-1494-T、A-1610-T、N-2015-S、E-2393-K）,称p50突变,导致更高滴度的VLVs产生。本研究利用SFV复制子表达密码子优化的RABV弱毒疫苗株LBNSE的G蛋白,成功获得了一株可以感染BHK-21细胞的狂犬病病毒样囊泡（VLVs-RVG）。在此基础上,将p50突变引入VLVs-RVG的感染性克隆中,获得了一株有较高滴度（约为10~6FFU/m L）的重组狂犬病毒样囊泡（rVLVs-RVG）,同时验证了rVLVs-RVG基因组上I-516-T突变是高滴度表型的必要突变。将rVLVs-RVG在BHK-21细胞上连续传代至25代时,其滴度提高至10~8FFU/m L,经过空斑纯化后获得了一株高滴度的狂犬病病毒样囊泡,将其命名为p25 rVLVs-RVG。比较p25 rVLVs-RVG和rVLVs-RVG在细胞上的增殖动力学可知,p25 rVLVs-RVG可以更快地感染周围细胞,拥有更高的滴度。通过对比p25 rVLVs-RVG和rVLVs-RVG的基因组发现,p25 rVLVs-RVG基因组中SFV复制酶编码区有3处氨基酸的改变（K-470-R、I-482-M、K-875-R）,RABV-G编码区有1处改变（S-61-R）,证明了SFV非结构蛋白1（ns P1）中K-470-R和I-482-M突变对这种高滴度表型至关重要。与此同时,构建了p25rVLVs-RVG的感染性克隆,并证明了拯救出的病毒样囊泡与亲本毒株生长特性一致。将p25 rVLVs-RVG感染性克隆中的细胞适应株LBNSE的G蛋白替换为野毒株SHBRV或DRV的G蛋白,或仅将LBNSE的G蛋白的胞外域替换为野毒株SHBRV或DRV的G蛋白胞外域后,VLVs均完全失去感染BHK-21细胞的能力。通过单个或2-3个替换LBNSE-G与DRV-G所有不同的氨基酸位点,发现替换胞外域靠近N端的一些氨基酸后p25 rVLVs-RVG滴度显著下降。因此推测细胞适应毒株LBNSE的G蛋白N端可能存在与VLVs感染BHK-21细胞密切相关的功能,而野毒株G蛋白不具备这种功能。体外试验证明,与RABV疫苗株LBNSE相比,p25 rVLVs-RVG感染小鼠小胶质细胞系（BV2）可以较强地诱导I型干扰素（Interferon,IFN）的产生。使用IFN-α2b和IFN-β预处理BHK-21细胞可以显著抑制p25 rVLVs-RVG的增殖。这可能是p25 rVLVs-RVG在体内有较高安全性的原因。体内试验表明,在直接感染成年小鼠脑部时,p25 rVLVs-RVG不引起脑部病理变化和炎症反应,不会使成年小鼠体重下降或死亡。在直接感染免疫系统不完善的乳鼠的脑部时,p25 rVLVs-RVG的致死率显著低于LBNSE,并且有着较高的安全剂量。p25 rVLVs-RVG免疫小鼠后诱导生发中心（Germinal centre,GC）B细胞、浆细胞（Plasma cells,PCs）、病毒中和抗体（Virus-neutralizing antibodies,VNAs）、总Ig G、Ig G1、Ig G2a和Ig G2b的生成与RABV活毒LBNSE几乎相当,且显著高于灭活LBNSE。p25 rVLVs-RVG免疫小鼠后可以使小鼠抵御RABV标准攻毒株CVS的攻击,保护率与活毒LBNSE相当且显著高于灭活的LBNSE。免疫犬和猫的VNAs数据表明,p25 rVLVs-RVG与灭活LBNSE效果相当,推测大动物机体先天免疫阻碍了VLVs在犬和猫体内的增殖。综上所述,含有RABV-G的VLVs可在细胞内增殖,且可以进化为较高滴度,这表明VLVs具有被开发为经济、安全、高效的狂犬病活疫苗的潜力。