1、课题来源：深圳市科技局资助项目,项目编号2007020322、研究目的和意义：肿瘤的发生是一个多步骤、多阶段、多基因改变的复杂过程。近年来,随着分子生物学技术的发展,人们逐渐把注意力由经典的核遗传学转移到了表遗传学,包括DNA甲基化、RNA干涉等。其中DNA甲基化作为表遗传学重要的分子机制之一,越来越受到人们的关注。甲状腺癌是内分泌腺体中最常见的恶性肿瘤,其病情进展相对缓慢,若能较早地诊断并积极手术治疗,则病人的预后较好。但以目前临床的手段较难对甲状腺占位做出良恶性质的判断,只能通过术后病理得知,确诊方法的滞后使得部分病人错过治疗机会或接收不必要的手术治疗。由此可见,探寻早期鉴别甲状腺占位病变良恶性的诊断方法具有重要的临床意义。抑癌基因甲基化所致的基因表达产物的缺失是目前肿瘤发生机制研究的热点之一。特别是它们对细胞周期的抑制作用和对细胞生长调节的影响,使其极有可能成为将来肿瘤基因治疗的候选靶点。患者血液中抑癌基因甲基化的水平检测可用于协助肿瘤诊断及判断肿瘤复发和(或)残留情况。对于基因甲基化与其他肿瘤的发生,国内已有报道,但对于甲状腺癌与抑癌基因甲基化的研究国内报道尚少。本研究采用RT-PCR(反转录—PCR)、MSP(甲基化特异性PCR)及基因测序等方法对甲状腺癌的抑癌基因：TSHR、P16INK4A、RASSF1A等进行研究,以探讨不同的抑癌基因在国人甲状腺癌的转录表达情况及甲状腺癌发病与这些抑癌基因启动子区甲基化的关系,寻找甲状腺癌发病的机制。同时,将三个抑癌基因甲基化的结果与患者临床病理资料相关引证,以求解其临床应用的意义。3、研究对象收集我院甲乳外科2007.01—-2009.10年收治的50例PTC患者的新鲜手术标本(PTC组),其中男15例,女35例,平均年龄(40±12)岁；另收集我院甲乳外科同期收治的32例良性甲状腺肿瘤患者作为对照组,包括结节性甲状腺肿20例,甲状腺腺瘤12例；其中男9例,女23例,平均年龄(37±12)岁。两组均手术获取标本,经病理检查确诊,标本切除后迅速转移至-80℃冰箱。4、实验方法：4.1三种抑癌基因甲基化研究：4.1.1组织DNA的提取：用QIAamp DNA Mini Kits 51304临床样品基因组提取试剂盒(美国Qiagen公司的)提取基因组DNA,2%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性,用紫外分光光度仪检测其含量和纯度,-20℃冰箱保存备用(图1)。4.1.2 DNA甲基化修饰：用CpGenome TM DNA Modification Kit S7820(美国CHEMICON公司)甲基化试剂盒按说明对提取的DNA进行亚硫酸氢钠处理和纯化,-20℃冰箱保存备用。4.1.3(巢氏)甲基化特异性PCR (MSP)扩增：P16基因采用巢氏PCR(nest PCR,nMSP)扩增,外引物使用Primer 3软件自行设计,三种抑癌基因的甲基化引物与非甲基化引物序列参照文献(正文表1),引物由上海生工公司合成。PCR所用试剂盒为2×PCR master mix K0171 (Fermentas公司)。甲基化和非甲基化PCR的反应体系均为25μl,上下游引物各1μl (10pmol/μl),甲基化修饰后的DNA2μl。所有产物均用2%琼脂糖凝胶电泳进行检测。P16基因第一轮PCR扩增条件：95℃预变性5min,95℃变性30s,60℃退火30s,72℃延伸30s,循环35个周期后,最后72℃延伸8min。取第一轮PCR产物0.3μl做MSP,三种抑癌基因(甲基化与非甲基化)扩增条件：95℃预变性5min,95℃变性30s,65℃(TSHR和P16基因)/60℃(RAS基因)退火30s,72℃延伸30s,循环30个周期,最后72℃延伸5min。4.1.4抑癌基因克隆及测序：每个抑癌基因各随机选取2例乳头状甲状腺癌及2例对照组织进行测序,其中P16基因甲基化和非甲基化PCR产物,纯化后直接进行测序,TSHR基因和RASFF1A基因因基因片段较小,均先克隆后再进行测序。(ABI3700测序仪,克隆及测序均由华大基因公司完成)。4.2三种抑癌基因mRNA转录表达研究：4.2.1组织RNA的提取：组织总RNA按照TRIZOL试剂盒操作说明书进行(Invitrogen公司),1%含甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测完整性,用日本UV-2450紫外分光光度计检测其含量和纯度(图2)。4.2.2cDNA的合成：以提取的总RNA为模版,按照反转录试剂盒说明书进行cDNA合成,所用反转录第一链cDNA合成试剂盒为K1622(Fermentas公司),2%琼脂糖凝胶电泳检测完整性。4.2.3反转录PCR(RT-PCR)检测(?)nRNA基因表达：三个基因所用PCR引物均使用Primer 3软件自行设计,引物序列见正文表1,由上海生工公司合成,PCR反应试剂盒K0171购自Fermentas公司,体系为25μl,取cDNA2μl进行PCR扩增,PCR反应体系：2×PCR Master mix 12.5μl,上下游引物各1μl (10pmol/μl),均以GAPDH作PCR体系内参照。GAPDH产物和待测基因一起上样,用2%琼脂糖凝胶电泳检测,对电泳结果采用图像分析系统进行积分吸光度测定(A值),以待测基因与GAPDH的比值为指标,来衡量TSHR、P16和RASFF1A三种抑癌基因的相对表达量。4.3统计学方法4.3.1两组基线数据均衡性检验：使用SPSS13.0软件,年龄使用均数±标准差(x蝴)表示,进行两独立样本t检验来评估两组间年龄有无组间差别。两组间性别均衡性使用Pearsonχ2检验来评估,以P<0.05为有统计学差异。4.3.2以Pearsonχ2检验分析三个抑癌基因PTC组与对照组间甲基化差别,以P<0.05为有统计学差异。4.3.3 PTC组与对照组间三个抑癌基因1mRNA表达数据使用均数士标准差(x±s)表示,进行两独立样本t检验,方差不齐时采用Satterthwaite近似t检验,以P<0.05为有统计学差异。4.3.4三个抑癌基因甲基化之间的相关性分析：用Spearman相关分析,以r值表示相关性大小,r越接近1,说明相关性越密切,以P<0.05为有统计学差异。4.3.5三个抑癌基因启动子甲基化和主要的临床病理参数的关系：以Pearsonχ2检验分析乳头状甲状腺癌组三个抑癌基因启动子甲基化和主要的临床病理参数的关系,以P<0.05为有统计学差异。5、实验结果5.1三个抑癌基因启动子甲基化分析：扩增产物中出现甲基化条带,则表明该位点发生甲基化,未出现甲基化条带,则表明该位点未发生甲基化。5.1.1TSHR基因：50例PTC患者中,34例TSHR基因启动子发生了甲基化,甲基化率为68.0%;32例对照组患者中,7例TSHR基因启动子发生了甲基化,甲基化率为21.9%,其中20例结节性甲状腺肿发现了4例甲基化,12例甲状腺腺瘤中发现了3例甲基化(见图3.1),两组患者甲基化率间差异有统计学意义(x2=16.61,P=0.000)。5.1.2 P16基因：50例PTC中,27例P16基因启动子发生了甲基化,甲基化频率为54%。32例对照组织中,5例P16基因启动子发生了甲基化,其中：20例结节性甲状腺肿发现了3例,12例腺瘤中发现了2例,对照组甲基化频率为15.6%(图3.2),两者甲基化率具有统计学差异(x2=12.08,P=0.001)。5.1.3 RASFF1A基因：50例PTC中,30例发生了RASFF1A基因启动子甲基化,甲基化频率为60%。32例对照组织中,10例发生了RASFF1A基因启动子甲基化,其中：20例结节性甲状腺肿发现了6例,12例腺瘤中发现了4例,对照组甲基化频率为31.25%(图3.3),两者甲基化率具有统计学差异(x2=6.46,P=0.011)。5.2测序结果：三个基因都随机测序2个PTC标本及2例对照组织标本的甲基化产物及非甲基化产物,三个基因启动子CpG岛的所有CpG位点均发生了甲基化,即甲基化引物扩增产物中的CpG位点的C仍然保持C,而非甲基化引物扩增产物中的CpG位点中的C转变为T(亚硫酸氢钠处理的DNA,经PCR扩增后,CpG位点发生甲基化的,C仍然保持C,CpG位点未发生甲基化的,C转变为T,图4.1-4.3)。5.3三个抑癌基因mRNA表达：5.3.1 TSHR基因：PTC组TSHR基因1mRNA半定量表达值为0.413±0.107,对照组织mRNA半定量表达值为0.629±0.078(图5.1),乳头状甲状腺癌TSHR基因：mRNA的表达低于对照组织,两者具有统计学差异(t=-10.534,P=0.000)。5.3.2 P16基因：PTC组P16基因mRNA半定量表达值为0.513±0.170,对照组织的1nRNA半定量表达值为0.723±0.224(图5.2),乳头状甲状腺癌P16基因mRNA的表达低于对照组织,两者具有统计学差异(t=-4.542,P=0.000)。5.3.3 RASFF1A基因：PTC组RASFF1A基因mRNA半定量表达值为0.562±0.114,对照组织的mRNA半定量表达值为0.669±0.156(图5.3),乳头状甲状腺癌RASFF1A基因mRNA的表达低于对照组织,两者具有统计学差异(t=-3.368,P=0.001)。5.4乳头状甲状腺癌三个抑癌基因甲基化之间的关系：5.4.1乳头状甲状腺癌TSHR和RASFF1A基因甲基化间的关系：PTC组织中TSHR和RASFF1A基因启动子均甲基化的为26/50；TSHR甲基化而RASFF1A基因非甲基化的为8/50；TSHR非甲基化而RASFF1A基因甲基V化的为4/50；TSHR和RASFF1A基因启动子均非甲基化的为12/50。整理资料成四格表,计算r=0.490(p=0.000),提示PTC组TSHR和RASFF1A两个抑癌基因甲基化之间存在显著相关性。5.4.2乳头状甲状腺癌TSHR和P16基因甲基化间的关系：PTC组织中TSHR和P16基因启动子均甲基化的为21/50；TSHR甲基化而P16基因非甲基化的为13/50；TSHR非甲基化而P16基因甲基化的为6/50；TSHR和P16基因启动子均非甲基化的为10/50。整理资料成四格表,计算r=0.227(p=0.113)；提示PTC组TSHR和P16两个抑癌基因甲基化之间存在不存在关联性。5.4.3乳头状甲状腺癌P16和RASFF1A基因甲基化间的关系：PTC组织中P16和RASFF1A基因启动子均甲基化的为16/50；P16甲基化而RASFF1A基因非甲基化的为11/50；P16非甲基化而RASFF1A基因甲基化的为14/50；P16和RASFF1A基因启动子均非甲基化的为9/50。整理资料成四格表,计算r=-0.016(p=0.910),提示PTC组P16和RASFF1A两个抑癌基因甲基化之间不存在关联性。5.5三个抑癌基因甲基化与患者临床病理资料之间的关系：结合患者的临床病理资料,RASSF1A基因甲基化与患者的年龄、性别、临床分期和淋巴结转移均未见相关性；TSHR基因和P16基因与患者的年龄、性别、临床分期均未见相关性,但与患者是否伴有淋巴结转移相关(P<0.05)。6、结论：6.1 PTC组织中三种抑癌基因比对照组的启动子甲基化率均高,同时比对照组的mRNA表达率均低,提示三种抑癌基因甲基化可能与乳头状甲状腺癌的发生均有关。6.2进一步对三种抑癌基因甲基化之间相关性进行分析,发现仅TSHR和RASFF1A之间存在关联性;而TSHR基因和p16基因,RASFF1A基因和P16基因之间并无协同作用,这可能是由于三种抑癌基因的作用不同：TSHR基因和RASFFIA基因主要作用于信号传导,而P16基因主要作用于细胞周期调节所致。6.3 PTC组织三种抑癌基因启动子甲基化,均与肿瘤的临床分期无关,提示三种抑癌基因启动子甲基化可能在甲状腺肿瘤的早期阶段既已发生；但TSHR和P16基因启动子在有淋巴结转移的乳头状甲状腺癌的甲基化率高于无淋巴结转移的病例,提示该两种抑癌基因启动子甲基化在甲状腺癌的恶性进展中可能发挥一定作用。基于我们的研究结果,我们推断以上三种抑癌基因启动子高甲基化可能均与PTC的发生和发展相关,而且三种抑癌基因启动子甲基化在肿瘤的早期阶段即已存在。