论文部分内容阅读
昆虫是世界上已知种类最多的一类生物,在自然界中分布极广。与昆虫种类研究相比,目前人们对昆虫共生菌及其代谢产物研究较少。昆虫共生菌因其宿主生存环境多样性而导致其生理生化特点鲜明,是新颖活性次生代谢产物的重要来源。因此,有必要对这类特境微生物及其活性代谢产物进行研究。本论文对黄蜻（Pantala flavescens）稚虫和中华婪步甲（Harpalus sinicus）的共生菌及代谢产物进行了初步研究。在黄蜻稚虫肠道分离并鉴定了1株真菌QTYC-77,测试了其抗黄瓜枯萎病菌活性并初步探究抗菌机理;运用硅胶柱层析、LH-20葡聚糖凝胶柱层析等色谱分离技术对QTYC-77的次级代谢产物进行分离纯化,共分离得到4个化合物。利用1H-NMR、13C-NMR、HMQC、HMBC、1H-1HCOSY和HR-ESI-MS等波谱技术对代谢物的结构进行分析,鉴定出3个化合物,其中有1个新化合物。采用稀释平板法和形态观察法从中华婪步甲中分离得到了35株共生放线菌。通过牛津杯法测试了其发酵液对4种致病菌的抑制活性,对抗菌活性显著的BJ37菌株进行了鉴定,并测试了其发酵液中不同极性组分的抗菌活性。主要研究内容简述如下:1.从黄蜻稚虫肠道分离到1株真菌QTYC-77,结合形态特征和ITS-rDNA基因测序初步鉴定为黄绿木霉（Trichoderma aureoviride）。平板抗菌对峙实验显示QTYC-77能有效抑制黄瓜枯萎病菌的生长,对黄瓜枯萎病菌的抑制率为71%。通过灌根法测定了木霉菌QTYC-77对黄瓜枯萎病菌的盆栽生防效果,防效高达67%,并且能明显促进黄瓜幼苗茎叶的生长。进一步测试了木霉菌QTYC-77抑菌机理:显微形态观察显示木霉菌QTYC-77能通过螺旋缠绕等方式寄生在黄瓜枯萎病菌菌丝上,引起黄瓜枯萎病菌的菌丝断裂,同时测定了帮助其寄生的几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶和胞外蛋白酶的不同发酵时间的酶活,三种酶活性均呈现出先上升后下降的趋势,在5 d时,三种酶活都达到了最大值,分别为0.1529 U/mL、1.3481U/mL和31.4261 U/mL。因此,木霉菌QTYC-77能通过分泌分解酶帮助其重寄生在黄瓜枯萎病菌上。通过代谢产物抑菌实验发现木霉菌QTYC-77发酵液中存在抑制黄瓜枯萎病菌生长的物质。2.从QTYC-77发酵液的乙酸乙酯萃取物中分离得到3个化合物,鉴定出了2个化合物,分别为:新化合物azaphilone D（1）,化合物2H-1-Benzopyran-2-one,8-hydroxy-3-（2-hydroxypropyl）-6-methoxy（2）。进一步对菌株采用烟酰胺表观遗传学修饰后,从中分离到化合物niacin（3）。抗菌活性测试表明在供试浓度为30μg/滤纸片时,新化合物1对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌具有抗性,其抑菌圈直径分别为7.3 mm和7.0 mm;化合物2和3对金黄色葡萄球菌也具有抗性,其抑菌圈直径分别为7.2 mm和7.5 mm。3.采用稀释平板法在中华婪布甲肠道中分离纯化得到35株共生放线菌。采用牛津杯法测定菌株发酵液及提取物（每牛津杯中加入100μL）的抗菌活性。结果表明有34株放线菌发酵液至少对1种供试菌具有抑制活性,其中菌株BJ37对枯草芽孢杆菌和白色念珠菌抑菌效果突出,抑菌圈直径分别可达49.2 mm和30.0 mm。通过对BJ37发酵液不同极性提取物抗菌实验表明,BJ37发酵液的乙酸乙酯萃取物对枯草芽孢杆菌和白色念珠菌的抑菌效果明显,浓度为100μg/mL时抑菌圈直径分别为34.1 mm和29.3 mm,其它部位的抑菌效果较差。结合形态特征和16s rDNA基因测序初步鉴定BJ37菌株为链霉菌属委内瑞拉链霉菌（Streptomyces venezuelae）。