随着人类基因组计划的完成和表达序列标签数据的积累和释放,电子克隆逐渐成为一种常用的方法,用来迅速获取所感兴趣的基因。在过去的工作中,我们实验室用差异显示方法从肝癌和癌旁组织中得到了大量的EST。为了获取新的基因用于以后的功能研究,我们选取这些EST作为信息探针,采用EST策略和试验结合的方法,进行人类新基因的研究工作。本论文分为两个部分,第一部分利用EST策略克隆了新的人和小鼠小G蛋白基因ARHT2、RHEBL1和假激酶基因STK40。第二部分是用同源克隆策略获得在睾丸中特异表达的新型乳酸脱氢酶基因LDHAL。 在第一部分第一章中我们用EST策略获得了一个新的小GTP酶ARHT2基因,RHO家族小G蛋白是是Ras GTP酶超家族的一个重要分支。ARHT基因是Rho家族新近发现的成员。它含有两个GTP酶结构域,两个EF-hand结构域。其激活型蛋白的超量表达可以导致细胞凋亡率的增加。此外我们还用同源克隆策略获得了其它物种的ARHT2基因。Northern结果显示人ARHT2转录本约2.6kb,在人体内广谱表达,在睾丸和前列腺中表达丰度很高。而小鼠Arht2也是广谱表达,也在睾丸中高表达。RT-PCR分析显示Arht2在不同发育阶段的小鼠睾丸中都有表达,表达量在出生后30天达到成年水平。原位杂交结果显示Arht2主要在生精小管的残体中表达。 在第一部分第二章中,我们用EST策略获得了另外一个新的小GTP酶基因RHEBL1,它是mTOR通路的关键调节蛋白Rheb的同源基因。人17种组织中的表达谱分析显示,RHEBL1呈广谱表达。RHEBL1主要分布于细胞质中。免疫共沉淀和荧光共定位试验表明RHEBL1可以和B-Raf相互作用,RHEBL1可以增强B-Raf的激酶活性,使ERK42/44的磷酸化增强,并激活c-myc通路。此外我们还发现,RHEBL1和其激活型突变体Q64L对NF-(?)B通路有类似的激活作用,这表明野生型的RHEBL1处于持续激活状态。而失活型的突变体D60K对NF-(?)B通路的激活作用明显减弱。今后的研究中我们将探讨RHEBL1是否可以以相同的机制参与mTOR通路的调控。 在本论文的第一部分第三章中我们用EST策略拼接并克隆了人和小鼠的假激酶样基因STK40,分析STK40推定的编码蛋白的序列发现其缺少几个与激酶内在活性相关的氨基酸残基,特别是缺少Ⅶ亚区的DFG基序,并且其中关键的天冬氨酸残基被天冬氨酰取代,这种取代在其他物种的同源基因中是保守的。