手足口病是一种常见的肠道病毒感染引起的疾病,其主要病原体为科萨奇16和肠道病毒71型(EV71),其患者主要是儿童。除了手足口病外,EV71还可引起严重的中枢神经系统疾病,如脑炎、脊髓灰质炎样麻痹。从2008年起,以C4亚型为主要病原体的手足口病在我国大规模爆发,严重影响了人民的健康和生活。到目前为止还没有成熟的EV71快速诊断试剂和预防疫苗,所以研究开发相关诊断试剂与疫苗对于手足口病的诊断和预防具有重要意义。本研究的目的是探索制备EV71的灭活疫苗的实验流程,所做的工作如下:建立针对肠道病毒71型的病毒分离和鉴定技术平台,初步获得符合标准的EV71病毒库;建立EV71鉴定和支原体检测的巢氏PCR法;从EV71收获液中浓缩并初步纯化病毒颗粒。本研究结果将为EV71的预防和控制提供重要工具,打下一定的基础。病毒粪便标本分离后对肠道病毒71型安徽、河南分离株的VP1序列(编码病毒衣壳蛋白的核苷酸序列1)进行测定,参照EV71 A、B、C各基因型的参考株和以往中国EV71的分离株进行同源分析和构建系统发生树。结果表明,所分析的9株病毒株均为C4亚型,H7、H8、H9三株安徽株的VP1序列相似度很高(≥98.8%,其中H7、H9的相似度为100.0%),H3、H4、H5、H6四株河南株相似度很高(≥98.4%,H3、H4、H5≥99.6%,其中H3、H4的相似度为100.0%),它们同H1、H5河南株的相似度也较高(≥97.2%),安徽株H7、H8、H9株变异速率明显加快,这可能导致了手足口病在安徽省的率先爆发与大流行,河南株H2虽然与其它河南株具有较高的序列相似度,但进化分析表明其与安徽株同源性较高,河南株H2最初可能由安徽传入河南。以上研究对于我国EV71的基因归类、分子流行病学研究、EV71的流行规律和EV71引起的相关疾病的治疗和预防都有参考价值。本研究在EV71病毒的分离、鉴定的过程中,建立了EV71鉴别和支原体检测的巢式PCR法。本研究通过EV71病毒的分离、鉴定和纯化,建立了一个具有我国地域性的肠道病毒库,并且初步建立了EV71病毒的大规模培养、破碎、浓缩和初步纯化的一整套工艺,已获得了具有较高滴度和纯度的EV71病毒颗粒,为后期的疫苗研发等工作提供了基础。