革兰阴性杆菌是目前临床最常见的致病菌，而且其耐药性日益严重。本文对第三代头孢菌素和氟喹诺酮同时耐药的志贺菌、多重耐药的非01、非0139霍乱弧菌、对哌拉西林/他唑巴坦等含酶抑制剂抗菌药物，以及头孢哌酮耐药而对头孢噻肟敏感的大肠埃希菌等菌株进行了研究，并把耐药基因与其遗传环境有机地联系起来，研究其耐药性转移的机制。 一、产超广谱β-内酰胺酶福氏志贺菌中质粒介导的喹诺酮耐药基因qnrS的发现和研究 目的：明确一株对第三代头孢菌素和氟喹诺酮同时耐药的福氏志贺菌的分子机制，了解质粒介导喹诺酮耐药基因的结构特征。 方法：通过接合试验了解耐药性是否由质粒介导；用PER分别扩增染色体和质粒介导的喹诺酮耐药基因并进行序列分析，检测染色体介导耐药的突变位点和质粒介导耐药的基因型；用PER扩增CTX-M各组ESBLs基因并进行序列分析，检测RJ506所携带ESBL的基因型；对耐药质粒进行“鸟枪法”随机克隆实验并对插入到克隆载体pACYC184的EcoRI酶切片断进行测序，检测和分析qnrS基因的上下游结构。 结果：RJ506染色体DNA旋转酶GyrA亚基的83位发现Ser→Leu突变，而gyrB和pare未见突变；ESBLs基因blaCTX-M-3和喹诺酮耐药基因qnrS分别位于可接合质粒上；qnrS及其上下游序列的基因结构为“blaLAp-qnrS保守区域-CS12-fgc-like的形式。 结论：本实验首次在国内的志贺菌中检出质粒介导的喹诺酮耐药基因qnrS和CTX-M-3型ESBL，后者介导了细菌对第三代头孢菌素的耐药，前者可介导细菌对萘啶酸的耐药，而且其与DNA旋转酶GyrA亚基83位Ser→Leu突变的联合作用可导致细菌对环丙沙星的耐药；qnrS的起源和扩散可能与插入序列IS有关，其上下游的基因结构主要有两种形式，而我国检出的菌株上述基因结构完全相同。 二、非01、非0139霍乱弧菌中超广谱β-内酰胺酶(PER-1)的发现和研究 目的：是明确非01、非0139霍乱弧菌中ESBL的基因型及其遗传背景，以探讨该耐药基因传播的机制。 方法：通过表型确证试验确定细菌是否产生ESBL，通过接合试验了解ESBL是否由质粒介导，通过PCR扩增和序列分析确定ESBL的基因型，通过反向PCR和序列分析了解ESBL基因两侧的结构。 结果：ESBL表型确证试验确认菌株RJ354为产ESBL菌株，接合试验证实ESBL基因位于可接合质粒上，PCR、反向PCR扩增和序列分析确定其基因型为blaPER-1，该基因上游序列为ORF513，下游为gst-like基因。 结论：首次在世界范围内从非01、非0139霍乱弧菌中检出了ESBL-PER-1，而且首次发现该酶基因与一种新的基因元件ISCR1相连，后者可能介导前者的水平转移。 三、两种新的耐药基因dfrA27(对甲氧苄啶耐药)和adaA16(对链霉素/壮观霉素耐药)的发现和研究 目的：确定菌株RJ354中整合子的种类及整合子所携带基因盒的特征。 方法：通过PCR扩增检测不同种类的整合酶；用长片断PCR对整合子可变区全序列进行扩增，序列分析了解基因盒的数量和基因种类；通过pMD18-TSimpleVector载体分别对整合子全长PCR产物和adaA基因盒进行TA克隆和表达。 结果：菌株RJ354及其接合子均含有1类整合子，其可变区包含三个基因盒，其中的基因分别为arr-3和两种新的基因，这两种新基因所编码的蛋白分别与DfrA5和AdaA6具有75％和88％的一致性，整合子全长PCR产物TA克隆株表现为对利福平、甲氧苄啶和链霉素/壮观霉素耐药，反向、正向插入载体的adaA基因盒TA克隆株均表现为对链霉素/壮观霉素耐药。 结论：本试验在世界上首次发现了两种新的耐药基因dfrA27(甲氧苄啶耐药)和adaA16(链霉素/壮观霉素耐药)，它们位于可接合质粒上1类整合子的基因盒中，而且adaA16基因盒含有独立的启动子序列。 四、TEM-1β-内酰胺酶介导的大肠埃希菌对哌拉西林/他唑巴坦和头孢哌酮耐药机制的研究 目的：探讨临床分离大肠埃希菌RJ904对哌拉西林/他唑巴坦等含酶抑制剂抗菌药物和头孢哌酮的耐药机制。 方法：通过三相水解试验了解酶的水解特性，通过接合试验了解耐药性是否由质粒介导，通过“鸟枪法”随机克隆实验将耐药质粒经BamHⅠ和HindⅢ双酶切后的片段插入到克隆载体pACYC184中表达并二、非01、非0139霍乱弧菌中超广谱β-内酰胺酶(PER-1)的发现和研究。本实验的目的是明确非01、非0139霍乱弧菌中ESBL的基因型及其遗传背景，以探讨该耐药基因传播的机制。通过表型确证试验确定细菌是否产生ESBL，通过接合试验了解ESBL是否由质粒介导，通过PCR扩增和序列分析确定ESBL的基因型，通过反向PCR和序列分析了解ESBL基因两侧的结构。 结果：ESBL表型确证试验确认菌株RJ354为产ESBL菌株，接合试验证实ESBL基因位于可接合质粒上，PCR、反向PCR扩增和序列分析确定其基因型为blaPER-1，该基因上游序列为ORF513，下游为gst-like基因。 结论：首次在世界范围内从非01、非0139霍乱弧菌中检出了ESBL-PER-1，并首次发现该酶基因与一种新的基因元件ISCR1相连，后者可能介导前者的水平转移。