人凝血因子VII单克隆抗体的制备与应用初探

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目的:探索从血浆蛋白生产Cohn氏法组分Ⅲ(组分Ⅲ)纯化人凝血因子Ⅶ(FⅦ)的方法;制备能稳定分泌人FⅦ单克隆抗体的杂交瘤细胞株;纯化人FⅦ单克隆抗体以及初探其应用。方法:(1)将组分Ⅲ溶解,经柠檬酸钡吸附、洗脱、硫酸铵沉淀、两次DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析和Sephadex G-100凝胶过滤纯化人FⅦ。(2)以纯化的人FⅦ为抗原免疫BALB/c小鼠,用免疫后小鼠的脾细胞与SP2/0鼠骨髓瘤细胞进行融合,间接ELISA方法筛选出能分泌人FⅦ单克隆抗体的鼠-鼠杂交瘤细胞;并用杂交瘤细胞体内诱生法从小鼠的腹腔制备腹水,经过硫酸铵沉淀、DEAE-affi-gel-blue凝胶层析纯化单克隆抗体:鉴定抗体的亚类、抗体与凝血因子Ⅱ、Ⅸ、Ⅹ(FⅡ、FⅨ、FⅩ)的交叉反应性、二价金属离子对抗原抗体结合的影响等特性。(3)把人FⅦ单克隆抗体连接到GoldMag-@金磁微粒表面,检测连接效率和连接后的抗体与血浆和浓缩FⅦ的反应,用含有二价金属离子的缓冲液进行洗脱,探索用单克隆抗体制备缺乏FⅦ血浆、纯化FⅦ的方法和可行性。结果:(1)从400g组分Ⅲ中最终提取到10.1mgFⅦ,活性为1775.8U/mg,FⅦ被浓缩了近6000倍,最终的回收率为17.6%,SDS-PAGE电泳鉴定只有1条主条带。(2)成功制备出22株分泌人FⅦ单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为HFⅦ001~022,从其中选取6株制备腹水,并对抗体进行纯化。6株抗体重链的亚类均为IgG1;抗体均和FⅡ、FⅨ、FⅩ没有交叉反应;其中有2株抗体与FⅦ的结合明显受Zn2+的抑制;有1株抗体可以抑制血浆FⅦ的凝血活性。(3)抗体与金磁微粒结合效率很高;结合后的抗体,有1株可以把血浆中的部分FⅦ分离出来;有3株
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