研究背景及目的：食管癌是我国的高发癌种,死亡率高,居于我国恶性肿瘤死亡率的第4位,其分布有明显的地域性,山东省是我国食管癌高发区之一。食管癌与其他消化道肿瘤一样呈高侵袭性生长,并且容易发生扩散转移。血管生成(angiogenesis)存在于许多生理和病理过程中,它既可参与胚胎发生、创伤修复、女性生殖周期等生理过程,又是炎症反应、类风湿性关节炎、糖尿病、视网膜病、肿瘤等病理过程中的重要环节。近年来研究发现血管生成对实体肿瘤的生长、进展、转移的作用尤为重要。实验研究表明,抗血管新生治疗可以抑制肿瘤的生长,降低其复发、转移的能力。血管生成是一个多因素参加的协同作用过程,受多种因子的调控。血管内皮生长因子(Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF)是最主要的促血管生成因子,在血管生成过程中发挥着重要的作用。血管内皮生长因子在肝癌、肾癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌等中的作用已经得到证实,而其对食管癌生物学行为的影响方面文献报告不多。RNAi是指双链RNA(dsRNA)进入细胞后特异性阻断与其同源的基因表达的现象。它是当前研究基因功能的重要工具,而且已有人将其用于肿瘤、病毒感染基因治疗的研究。用慢病毒(Lentivirus)做载体介导RNAi用于基因治疗的研究更有实际应用潜力,因为与其它病毒载体系统相比,慢病毒能转导非分裂(Non-dividing)细胞并将shRNA表达结构整合到宿主细胞基因组,实现目的基因的稳定沉默。本文从蛋白水平研究VEGF-C基因在食管癌中的表达,观察其与临床病理学指标的关系；我们用RNA干扰技术破坏VEGF-C mRNA,使VEGF-C蛋白的合成处在极低的水平,降低VEGF-C积聚及对下游基因的转录调控,能够在很大程度上阻断肿瘤细胞的应答,建立一种基因修饰食管癌治疗策略,提高食管癌的治疗效果,为探讨以VEGF-C为靶标建立食管癌早期诊断和基因治疗方法提供理论依据和技术对策。第一部分VEGF-C基因在食管癌组织中表达水平的研究[方法]：选取山东大学附属省立医院胸外科1998-2001年手术切除的食管鳞状细胞癌标本46例。男性36例,女性10例；年龄30岁-74岁,中位年龄56岁；根据组织学分级：Ⅰ级8例,Ⅱ级28例,Ⅲ级10例；根据浸润深度分为三组：侵及黏膜固有层或黏膜下层2例,侵及肌层21例,侵及纤维外膜22例,侵及胸主动脉1例；区域淋巴结：有转移14例,无转移32例；根据UICC1997年分期标准,1期2例,Ⅱa期31例,Ⅱb期5例,Ⅲ期8例。所有病例均随访5年以上术前均未行放、化疗。免疫组化按武汉博士德生物公司SABC免疫组化染色试剂盒说明书操作,兔抗人VEGF-C多克隆抗体(工作浓度1:50)、兔抗人F8因子相关抗原抗体(工作浓度1:200)。VEGF-C阳性表达判定标准：高倍视野下观察,>30%肿瘤细胞内含有棕黄色颗粒且染色强度高于正常平滑肌细胞染色者判为“+”；<30%肿瘤细胞染色强度高于正常平滑肌细胞或肿瘤细胞染色与正常平滑肌细胞相近者判为“土”；肿瘤细胞染色强度低于正常平滑肌细胞染色者判为“-”。“+”者判定为VEGF-C阳性表达。MVD计数标准：先于100倍视野下扫视整个切片找到高血管密度区,即“热点”(Hot Spot),再以200倍视野下(0.7386mm2/视野)计数微血管数目,分别计数3个不同视野,取其最高值表示MVD。计数微血管时,无论是否有血管腔,凡是呈棕褐色染色的单个内皮细胞、细胞簇,与邻近的组织有明确界限者均计数在内。血管腔大于8个红细胞直径总和及正常粘膜下区的微血管不计数在内。统计学处理:VEGF-C的表达与性别、年龄、肿瘤大小、分化程度、浸润深度、病理分期(pTNM)、淋巴结转移、术后生存期关系以x2或四格表确切概率法检验；VEGF-C的表达与MVD关系以秩和检验；VEGF-C的表达与患者预后关系以SPSS统计软件绘制Kaplan-Meier曲线(生存率曲线)表示,生存率差异性检验采用时序检验。P<0.05被认为有显著性差异。[结果]：VEGF-C阳性物质主要位于肿瘤细胞的胞浆内,肿瘤浸润边缘阳性染色强度高于肿瘤中心区域。在食管鳞癌组织中VEGF-C的阳性表达率为45.65%(21/46),显著高于食管正常黏膜组织(P<0.05)；VEGF-C的阳性表达与食管鳞癌的浸润深度(T1-2,30.43%；T3-4,60.87%;P<0.05)、分化程度(Ⅰ,00%；Ⅱ,50.00%；P<0.05；Ⅰ,0.0%；Ⅲ,70.00%；P<0.01)及MVD(P<0.05)显著相关。VEGF-C阳性表达与患者性别、年龄、肿瘤大小、TNM分期及淋巴结转移均无显著的相关性(P>0.05)。生存分析显示46例患者总的5年生存率为36.96%,其中VEGF-C阳性表达者术后5年生存率为14.29%,VEGF-C阴性表达者术后5年生存率为56.00%,P<0.05,差异有显著意义。Kaplan-Meier生存率曲线分析的结果显示,VEGF-C阴性表达患者的累积生存率显著高于VEGF-C阳性表达患者,经时序检验差异有显著意义(P<0.01)。[结论]：本研究证明VEGF-C在食管癌组织中存在异常表达,且其异常表达参与食管鳞状细胞癌的浸润及血管生成,并与患者不良预后密切相关。上述研究结果提示VEGF-C基因异常表达可作为判断食管鳞癌的恶性生物学行为及患者预后的重要指标,并可能成为食管癌基因治疗及抗肿瘤血管生成治疗的新靶标。第二部分构建RNAi慢病毒载体系统并筛选有效靶点[方法]：VEGF-C RNA干扰慢病毒载体的构建：采用Invitrogen公司的BLOCK-iT Lentiviral RNAi Expression System,构建入门克隆和病毒包装目的质粒。RNA干扰慢病毒的生产和滴度测定：四种质粒共转染293FT的方式生产病毒,病毒功能滴度测定用转导试验,分子滴度测定用定量PCR技术。进行基因稳定沉默细胞株的筛选：慢病毒转导EC109细胞后用Blasticidin筛选,建立VEGF-C基因沉默细胞株和对照细胞株,进行细胞瞬时转染实验。[结果]：本实验运用RNA干扰专业设计软件,针对目的基因VEGF-C靶基因序列设计三组shRNA干扰靶点序列,分别标记为1#/2#/3#,并构建成为vshRNA重组载体,将连接产物转入细菌感受态细胞,经过PCR鉴定,和测序比对。结果显示,三组shRNA重组载体被成功构建并测序无误。收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液,对其浓缩后得到高滴度的慢病毒浓缩液,在293T细胞中测定并标定病毒滴度。采用Realtime PCR的方法检测目的基因mRNA的表达情况,进而判断不同靶点的干扰效果。通过荧光图片可知目的细胞的病毒感染效率达到90%以上。三个靶点中,3#靶点是RNAi的有效靶点。相对NC组,目的基因的表达水平下调约30%。比较高低MOI的数据可以看到,高MOI时敲减的效果更好。并对VEGF-C-siRNA的合成和抑制表达效果进行检测。[结论]：通过该部分实验,我们成功构建了三组特异性shRNA慢病毒载体,RNAi慢病毒的包装也同时完成,并在293T细胞中完成病毒包装后的滴度标定。我们又从三组重组载体中筛选出高效率的靶点,并明确不同MOI值的非特异的毒性差异,为下一步选用最高效率的重组载体对食管癌细胞进行转染提供了可靠的依据。另外我们也初步验证了VEGF-C-siRNA在EC109细胞中有明显的抑制作用。第三部分RNA干扰目的细胞效果评定及干扰后细胞生物学行为的改变[方法]：培养生长状态良好的EC109细胞,病毒感染前一天将目的细胞分入6-well培养板培养,感染当天按实验设计的组别分别加入RNAi慢病毒颗粒进行目的细胞的感染实验。感染3天后荧光显微镜下观察GFP表达情况,感染5天后收集细胞,应用CCK8、流式细胞仪研究VEGF-C对食管癌细胞株体外增殖能力、细胞周期和迁移能力的影响。用克隆形成实验印证VEGF-C的促增殖作用。用Matrigel侵袭实验研究VEGF-C对食管癌细胞株体外侵袭能力的影响。[结果]：干扰组的细胞生长曲线较其它两组细胞(空白对照组以及无意义序列重组载体组)出现明显的压低,同时细胞活力明显降低,这一结果提示在VEGF-C基因被干扰后,食管癌细胞的增殖能力明显减弱,肿瘤细胞的生长能力被抑制。过表达VEGF-C可促进食管癌细胞株体外增殖、迁移和细胞周期的进展,抑制表达VEGF-C对于食管癌细胞株体外增殖、迁移和细胞周期的进展有抑制作用。另外沉默VEGF-C基因可明显抑制食管癌细胞株体外侵袭能力。[结论]:我们采用了慢病毒载体系统针对VEGF-C基因构建了shRNA重组载体,并成功在人食管癌细胞株中实现了高效、特异、稳定的沉默效果。该基因被沉默后,我们看到食管癌细胞增殖周期延长,细胞体外侵袭能力明显受到抑制等生物学行为的变化。