第一部分 254例耐药肺结核患者克拉霉素耐药情况及影响因素分析[目的]克拉霉素(clarithromycin,Clr)曾被世界卫生组织(WHO)列为第五组抗结核药物,但2016年WHO相关指南因考虑结核分枝杆菌对克拉霉素具有耐药性、疗效不明确、以及可能导致Q-T间期延长等不良反应而将其剔除。对此,国内外专家存在争议。本研究分析254例耐药肺结核患者克拉霉素耐药情况及相关影响因素,为其临床应用或剔除提供依据。[方法]收集2017年1月至2018年1月在首都医科大学附属北京胸科医院确诊为耐药肺结核的254例患者的临床资料和药物敏感性试验(简称“药敏试验”)结果进行回顾性分析。其中,采用比例法对克拉霉素等16种抗结核药物进行药敏试验检测。采用logistic回归法分析克拉霉素耐药的临床相关危险因素。[结果](1)254例耐药肺结核患者中,17例耐多药/广泛耐药患者对克拉霉素耐药,耐药率为6.69%(17/254),低于其余15种抗结核药物[12.60%(32/254)～95.67%(243/254)]。(2)对克拉霉素耐药的患者,对莫西沙星(47.06%,8/17)、氯法齐明(70.59%,12/17)、乙胺丁醇(82.35%,14/17)、阿米卡星(52.94%,9/17)、对氨基水杨酸(76.47%,13/17)、对氨基水杨酸异烟肼(88.24%,15/17)、卷曲霉素(76.47%,13/17)的耐药率高于对克拉霉素敏感的患者[莫西沙星(11.32%,24/212)、氯法齐明(9.91%,21/212)、乙胺丁醇(41.51%,88/212)、阿米卡星(21.70%,46/212)、对氨基水杨酸(35.85%,76/212)、对氨基水杨酸异烟肼(52.83%,112/212)、卷曲霉素(28.77%,61/212)],差异均有统计学意义(χ2值分别为 16.721、46.987、10.628、6.793、10.930、7.986、16.370,P 值均<0.05)。(3)logistic 回归显示耐药的药品数目>7 个[P=0.004,OR(95%CI)=9.328(2.058～42.290)]是克拉霉素耐药的危险因素。[结论]耐药肺结核患者克拉霉素的耐药率低于其他常用抗结核药物,多发生在耐多药/广泛耐药患者,耐药的药品数目>7个是患者对克拉霉素产生耐药的主要危险因素。提示Clr有可能作为Clr敏感的耐药结核病患者在无足够数量的抗结核药物组成化疗方案时的备选药物。第二部分 克拉霉素对耐多药结核分枝杆菌体外活性的研究[目的]克拉霉素(Clarithromycin,Clr)属于半合成14元环二代大环内酯类抗生素,通过抑制细菌蛋白质合成达到抗菌作用。其对结核分枝杆菌标准株H37Rv的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)为 8 μ g/mL,但 Clr对结核分枝杆菌耐药分离株体外活性的报道较少。本研究测定克拉霉素及与其余七种常用抗结核药物对结核分枝杆菌标准株H37Rv及耐多药结核分枝杆菌临床分离株的体外抗菌活性,并评价Clr与其余五种抗结核药物相互作用关系,为其合理选择或剔除提供依据。[方法]选择结核分枝杆菌标准株H37Rv和3株耐多药结核分枝杆菌临床分离株(MDR-1、MDR-2、MDR-3),采用7H9液体培养基进行培养。应用MABA法测定Clr及其余七种抗结核药物(Mfx、Lzd、Cfz、Am、Bdq、EMB、Lfx)对结核分枝杆菌标准株H37Rv及耐多药结核分枝杆菌临床分离株的最低抑菌浓度(MIC),评估其体外活性。选择结核分枝杆菌标准株H37Rv和1株耐多药结核分枝杆菌临床分离株(MDR-1),通过微量棋盘稀释法,测定Clr与Mfx、Lzd、Cfz、Am、Bdq等五种抗结核药物联用时的MIC,计算部分抑菌浓度(fractional inhibitory concentration,FIC),评估药物的相互作用关系。[结果](1)Clr对标准菌株H37Rv的MIC值为6.57 μ g/mL,范围为6.57～7.07μ g/mL,高于其余七种抗结核药物。Clr对3株耐多药结核分枝杆菌临床分离株(MDR-1、MDR-2、MDR-3)的 MIC 值范围为 2.61～7.59 μ g/mL,仍高于其余七种抗结核药物;(2)对结核分枝杆菌标准株H37Rv,Clr与Lzd联用效应为协同(FIC=0.43),Clr与Am联用效应为拮抗(FIC=4.26),Clr分别与Mfx、Cfz、Bdq联用效应为无关(FIC分别为1.20、2.26、1.26)。对耐多药结核分枝杆菌临床分离株(MDR-1),Clr与Lzd、Mfx、Bdq联用效应为相加(FIC分别为0.76、0.92、0.91),而Clr分别与Cfz、Am联用效应为无关(FIC分别为1.47、1.23)。[结论]Clr对结核分枝杆菌标准株H37Rv及耐多药结核分枝杆菌临床分离株体外活性低于较其余七种抗结核药物。对结核分枝杆菌标准株H37Rv:Clr与Lzd联合应用存在协同作用,与Am具有拮抗作用;对耐多药结核分枝杆菌临床分离株,Clr与Mfx、Lzd和Bdq等分别联合应用时具有相加作用。提示Clr在难以组成MDR-TB、特别是XDR-TB化疗方案时可作为备选药物,为减少Lzd剂量,从而降低不良反应发生率和降低患者经济负担提供便利。第三部分 克拉霉素及含克拉霉素化疗方案对MDR-TB小鼠模型治疗作用的探讨[目的]MDR-TB的治疗转归不尽人意,据2019年WHO报告:全球MDR-TB治疗成功率为56%,中国为52%。这可能与缺乏抗结核新药、缺乏合理有效的化疗方案、疗程长、副作用大、患者依从性低、经济负担重等因素有关。“十一五”、“十二五”期间,依托国家科技重大专项,采用含Clr、六药组成、疗程为18个月的化疗方案对MDR-TB患者进行治疗,其治疗成功率为64.66%,高于全球和中国的平均水平;而病死率为2.33%,低于全球平均水平。此外,有文献报道包括Clr在内的大环内酯类药物具有免疫调节作用,能够抑制病原体感染所导致的“细胞因子风暴”,通过免疫调节机制使呼吸系统疾病患者获益。为此,本研究探究Clr在MDR-TB小鼠模型内的抗结核作用及免疫活性;观察并评估含Clr化疗方案对MDR-TB小鼠模型疗效及聊城中相关细胞因子的动态变化,为Clr的合理选择或剔除提供依据。[方法]以耐多药结核分枝杆菌临床分离株(MDR-1)菌悬液(5×106CFU/ml),经气溶胶感染装置感染157只BALB/c雄性小鼠,建立小鼠MDR-TB小鼠模型,将MDR-TB小鼠随机分为以下六组:A组28只(空白对照组(CMC组))、B组20只(Clr治疗组)、C组35只(含Clr化疗方案组:Clr+Mfx+Z+Am+EMB+Pto)、D组35只(对照组:Mfx+Z+Am+EMB+Pto)、E组35只(对照组:Lfx+Z+Am+EMB+Pto)、F组4只(健康组)。感染第14天开始给予治疗,A组MDR-TB小鼠予0.5%羧甲基纤维素钠、B组予Clr(200mg/kg)、C、D、E组MDR-TB小鼠予上述方案治疗。疗程中各组每月末处死5只小鼠,获取肺脏、脾脏大体标本、质量指标、细菌学指标等综合评估疗效。C、D、E组MDR-TB小鼠治疗6月(20个剂量/月)后,停药3月观察细菌学复发情况。每月疗程结束后每组处死3只小鼠行摘眼球取血,获取血清,采用Luminex多因子试剂盒检测IL-2、IL-4、IL-10、IL-13、IFN-γ等五种细胞因子水平。[结果](1)20只空白对照组MDR-TB小鼠(CMC组)在建模后第23天开始自然死亡,至建模后30天共死亡14只,病死率70%(14/20),存活率为30%(6/20)。B组MDR-TB小鼠(Clr组)在建模第14天开始予以Clr治疗,至治疗四月末,未见自然死亡现象,存活率为100%。与建模第3天、第14天的空白对照组MDR-TB小鼠相比,①自然死亡的MDR-TB小鼠肺脏充血、水肿更为严重,且存在分布密集、大小不等的灰白色结核病灶,部分病灶似有融合现象。且其脾脏充血更为严重;②肺脏、脾脏菌负荷均明显增高(9.31±0.18、6.03±0.27)(P<0.01);③体重(14.69±1.15)降低,肺重(0.78±0.07)、肺指数(5.29±0.43)、脾指数(0.71±0.17)增高(P<0.01),但脾重无变化(P>0.01)。(2)Clr治疗一月末,与空白对照组MDR-TB小鼠比较,①Clr组MDR-TB小鼠肺脏结节病灶显著缩小。②Clr组MDR-TB小鼠体重增加5.69g,肺重、肺指数、脾指数平均降低0.149g、0.012、0.006(P<0.05),但脾重无统计学差异(P>0.05)。③肺脏活菌计数降低1.12 LgCFU(P<0.05),脾脏活菌计数结果无明显变化(P>0.05)。Clr治疗过程中,①Clr组MDR-TB小鼠肺脏病变逐渐好转,至4月疗程末残余少量病灶,脾脏变化不显著。②体重、肺重、脾重、肺指数、脾指数均较治疗前增高(P<0.01)。③肺脏活菌计数逐月降低,较治疗一月末降低0.98 LgCFU(P<0.05),但至治疗4月末其肺脏未达到无菌化状态;脾脏菌负荷无显著变化。(3)MDR-TB小鼠予三个化疗方案治疗后,①与治疗前(D0)和疗程1月末的空白对照组(CMC组)相比较,含Clr方案组MDR-TB小鼠肺脏病灶大小逐月缩小,病灶数量亦逐月减少。虽然至疗程末残余数量不等的结核病灶,但明显少于E组。②与空白对照组(A组)相比,含Clr方案组(C组)MDR-TB小鼠治疗后体重逐月增加(P<0.05),肺重、脾重、肺指数和脾指数逐月降低(P<0.05)。但除了个别指标在个别时间点的差异以外,其基本变化趋势与D组和E组MDR-TB小鼠相类似(P>0.05)。③含Clr方案组(C组)MDR-TB小鼠治疗后,1～4月末肺脏、脾脏菌负荷较治疗前(D0)和疗程一月末空白对照组(A组)逐月降低(P<0.05),且其肺脏菌负荷低于D组和E组(P<0.05);但其脾脏菌负荷高于D组和E组(P<0.05)。治疗至5月末,肺脏仅见极少量菌落,无法计算LgCFU;脾脏负荷均为0,达无菌化状态。治疗至6月末,肺脏菌落计数为0,达无菌化状态。但E组肺脏未达无菌化状态。(4)含Clr方案组(C组)停药三月后,其MDR-TB小鼠肺脏、脾脏细菌学复发率均为25%(1/4),而D组肺脏、脾脏复发率均为60%(3/5),E组肺脏菌负荷达6.04LgCFU、脾脏复发率100%(5/5)。(5)MDR-TB小鼠建模第3天(D-11),其血清IL-2和IL-10较健康组小鼠增高、IFN-γ和IL-4较健康组小鼠降低(P<0.05),IL-13与健康小鼠相接近(P>0.05)。MDR-TB小鼠予Clr(B组)和含Clr的化疗方案(C组)治疗后,血清IL-2、IL-4、IL-13较治疗前无明显变化;IFN-γ水平则在Clr治疗后逐渐增高,至疗程末与健康组小鼠相接近(P>0.05),但在含Clr的化疗方案治疗后无变化;IL-10水平较治疗前略降低。除个别指标在个别时间点的数据外,此变化趋势与D组和E组基本相类似。[结论]Clr具有一定的体内抗结核活性,可抑制耐多药结核分枝杆菌在MDR-TB小鼠体内的生长繁殖,降低其肺脏的菌负荷,促进其肺脏病变的吸收与修复,缓解其呼吸功能不全,保护其免于死亡。含Clr的化疗方案可较快的降低MDR-TB小鼠肺脏、脾脏菌负荷,使其在治疗5～6月末达到无菌化状态,促进受累脏器的病变好转,改善MDR-TB小鼠的营养状态,复发率低于对照组。疗效优于两个对照方案。Clr和含Clr化疗方案主要影响MDR-TB小鼠血清IFN-γ和IL-10的水平,通过上调IFN-γ水平、下调IL-10水平,促进以Th1为主的免疫反应,从而促进结核分枝杆菌的清除、肉芽肿的形成,使结核病变得以控制。