角蛋白的绿色提取及其水凝胶材料的制备与评价

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目前,世界上大量的羽毛被废弃,造成了资源的严重浪费和环境的污染。在现今及以后的社会经济中,绿色经济将越来越重要,因此,资源的回收利用和保护环境也将变得愈来愈重要。角蛋白是一种广泛存在于人和动物表皮、毛发以及动物壳、爪等组织的纤维状蛋白质,其一级结构中半胱氨酸含量高达7-20%,并以二硫键形式稳定存在。研究表明,角蛋白具有无免疫原性、生物相容性好、可生物降解等特性,在组织工程支架材料、药物载体等领域具有重要应用价值。然而,大量二硫键的存在使得角蛋白的水溶性较低,且较难采用普通的化学或物理方法将之从羽毛中提取出来。目前,已报道的角蛋白提取方法有还原法、氧化法、机械法、酶解法。其中还原法因过程简单,且保留了角蛋白原有的巯基性质而被广泛采用。但是,目前有关角蛋白提取方法的研究,大多侧重于角蛋白产率的提高,鲜有关注提取方法对角蛋白性质的影响。本论文首先考察了还原剂种类,如传统的偏重亚硫酸钠和绿色无害的半胱氨酸对角蛋白提取产率及其性质(形态、二级结构、分子量、成分、力学性能)的影响。结果表明:以半胱氨酸作为还原剂,p H=11,70℃反应条件下得到的角蛋白在水溶性、蛋白液粘度等方面优于偏重亚硫酸钠法。此外,比较了透析方法和干燥方法对角蛋白性质的影响。发现透析对角蛋白性质影响不大,采用冷冻干燥法要优于真空干燥和烘箱干燥方法。以半胱氨酸还原法得到的角蛋白为原料,分别采用二硫键重排法和溶剂蒸发法制备水凝胶,并通过电镜,流变,力学测试等研究发现采取二硫键重排法制备的凝胶成胶时间短,孔隙结构紧密,力学强度高,降解速率慢。究其原因为在该方法中,通过向蛋白水溶液中添加少量的半胱氨酸,使蛋白内部原本的二硫键被打开,经氧气氧化后,生成新的二硫键。随后考察了蛋白浓度对凝胶性质的影响,发现在一定的蛋白浓度范围内,浓度的增加对凝胶的强度有一定的增强。此外,考虑到冷冻干燥法制备蛋白粉末时间长,仪器成本高,本论文还尝试采用真空干燥法制备角蛋白粉末,并以此为原料制备凝胶。结果发现需要在碱性条件下才能使得角蛋白有较好的溶解;采用二硫键重排法制备凝胶时能有效的降低角蛋白溶解所需的p H,且制成的凝胶性能在力学性能较好。最后,本论文初步探讨了角蛋白水凝胶的细胞相容性及作为药物载体方面的应用。以新生小鼠颅骨成骨细胞为模型,采用CCK-8法考察角蛋白凝胶的细胞相容性,结果表明该凝胶对细胞的生长有一定的促进作用。以环丙沙星为药物模型,二硫键重排法所得到的角蛋白水凝胶能够对药物起到较好的缓慢释放的效果,20天左右药物释放达到60%,并具有一定的抗菌效果。
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