食虫沟瘤蛛细胞色素P450基因的克隆和序列分析

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细胞色素P450单加酶系是广泛存在于几乎所有生物体中的一类代谢酶系,是多功能氧化酶的重要的组成部分,起着与底物结合以及末端氧化酶的作用,具有底物氧化性和功能多样性的特征,可以代谢多种内源性和外源性物质,参与大部分药物的氧化代谢和杀虫剂、除草剂等外源物质的解毒,而对杀虫剂的代谢是昆虫产生抗药性的主要机制。P450因其生物学的重要性,一直是生物学研究的一个重要对象。   目前在昆虫中已经克隆得到的细胞色素P450基因有200多个,但主要都集中于棉铃虫(Heliothis armigera)、淡色按蚊(Anopheles albimanus)、家蚕(Bombyx mori)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、家蝇(Musca domestica)、烟草天蛾(Manduca sexta)和赤拟谷盗(Tribolium castaneum)等有限的几种昆虫中,而且大部分都只是基因片段,全序列较少。而有关蜘蛛等害虫天敌体内细胞色素P450的研究报道极少,P450基因克隆和序列分析几乎是空白。   农田蜘蛛是重要的害虫天敌,是数量最多的捕食性节肢动物之一。随着化学农药的广泛应用,越来越多的害虫对杀虫剂产生了抗药性,同时,大量的蜘蛛等害虫天敌也被杀灭。研究害虫天敌的抗药性对于害虫天敌的保护、利用害虫天敌进行害虫生物防治有着重大的意义。   本实验以农田中常见的食虫沟瘤蛛为研究对象,首先运用RT-PCR的方法,克隆获得了5个食虫沟瘤蛛细胞色素P450基因cDNA核心片段(I~V),这5个核心片段的核苷酸序列长度均为452bp,编码150个氨基酸。通过序列比对和一致性分析,证实这5个P450基因cDNA核心片段属于P450基因超家族,而它们相互之间的一致性介于60%~80%。然后,采用cDNA末端快速扩增(Rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术,根据克隆得到的P450核心片段I,设计合成RACE特异引物,克隆得到了食虫沟瘤蛛细胞色素P450基因cDNA全长序列。该cDNA全长为2708bp,开放阅读框的范围是从第490个碱基到第2055个碱基,编码了521个氨基酸。推导的氨基酸序列中含有P450家族最为保守的血红素结合基序FXXGXXXCXG(氨基酸残基:583-592)。序列比对分析表明,食虫沟瘤蛛细胞色素P450基因cDNA全长推导的氨基酸序列与微小牛蜱(Boophilus microplus)的P4504W1、黑腹果蝇的P4504c3、赤拟谷盗的CYP4BN1、德国小蠊(Blattella germanica)的P4504c21、褐飞虱(Nilaparvata lugen)的CYP4CE1、致倦库蚊(Culex quinquefasciatus)的P4504d8、野桑蚕(Bombyx mandarina)的CYP4M5、谷实夜蛾(Helicoverpazea)的CYP4M7、美洲散白蚁(Reticulitermes flavipes)的CYP4U3v1以及圆背匐蟑螂(Blaberusdiscoidalis)的CYP4C1等的一致性均在30%~40%之间。以上结果同时说明本研究克隆得到的食虫沟瘤蛛P450基因属于P450CYP4基因家族。   综上所述,本研究克隆得到了5个食虫沟瘤蛛细胞色素P450基因cDNA的核心片段及一个食虫沟瘤蛛细胞色素P450基因cDNA的全长序列。研究结果将为研究昆虫天敌抗药性与细胞色素P450基因之间的关系提供理论基础。
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