论文部分内容阅读
一、研究背景:严重烧伤延迟复苏后,肠道组织的缺血缺氧:进一步导致细胞功能的紊乱、损伤及最终死亡。而长时间低动力循环,使循环淤滞和微血栓的形成从而诱发患者血小板的聚集和活化,在缺血部位聚集、趋化和浸润也是由预激白细胞导致的,进而造成毛细血管通透性增高,从而引发肠道组织间质水肿。进而损伤肠道粘膜,破坏肠道屏障,致使细菌和毒素容易移位,进而导致全身感染即全身炎症反应综合症(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)乃至多器官功能障碍综合症(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)。所以肠损伤是导致烧伤患者死亡的一个重要因素。细胞间粘附分子1(intracellular adhesion molecule-1,ICAM-1)又名CD54,免疫球蛋白超家族中的成员,介导黏附反应重要的黏附分子,是单链跨膜糖蛋白,其结构由胞外区、疏水的跨膜区及较短的胞质区组成,是一种重要炎症介质。CAM-1在细胞的运动游走、维持,炎症反应、免疫调节,血栓形成、和对肿瘤的治疗中发挥至关重要的作用。ICAM-1在血管内皮细胞上表达最强、上皮细胞及成纤维细胞也有表达。在肠组织毛细血管内皮细胞中,ICAM-1表达可破坏内皮细胞的完整性,导致血管通透性增加及肠水肿的形成。粘附分子上ICAM-1通过介导细胞与细胞间或与基质相互作用,发挥免疫监视作用,促进炎症反应的发生,在严重烧伤早期脏器损害发生发展中起着重要的作用。高迁移率族蛋白B1(high mobility group box 1protein,HMGB1)是35年前发现的一种与DNA结合的蛋白,普遍存在于多种动物细胞内,如胸腺,淋巴细胞等。HMGB1作为核蛋白的功能,参与了细胞核小体的从组,修复及增值等。HMGB1是一种内源性免疫佐剂也是晚期严重介质,各种炎症性疾病的发展起到重要作用,如烧伤,急重症胰腺炎,肿瘤等。但是关于HMGB1在严重烧伤延迟复苏大鼠肠道ICAM-1的表达中作用及初步机制尚不清楚。本课题采用大鼠30%TBSAⅢ度烧伤延迟复苏动物模型,观察严重烧伤延迟复苏所致急性肠损伤时肠组织中HMGB1的动态变化,并检测肠组织细胞间粘附分子(I CAM-1)表达及p38MAPK活性等的变化,探讨严重烧伤延迟复苏后肠损伤的发生机制与HMGB1的关系。以了解HMGB1在严重烧伤大鼠肠道ICAM-1的表达中的作用及机制,为进一步认识烧伤导致的肠损伤的发生提供新的思路及方法。二、研究目的:探讨HMGB1在严重烧伤延迟复苏大鼠肠道ICAM-1表达中的初步机制。三、实验方法:实验的Sprague–Dawley雌性大鼠56只,由安徽医科大学动物实验中心提供,体重在200~250g之间,将购买的大鼠在常温下饲养一周,随机分为N组(Normal,正常对照组,8只)、B组(Burn,烧伤延迟复苏24只)和S组(Sodium butyrate,烧伤延迟复苏+正丁酸钠,24只)。开始实验后,给大鼠腹腔内注射由安徽医科大学实验中心配制的3%戊巴比妥钠(30mg/kg)麻醉,去除大鼠背部毛发,用恒温仪将水设置到98°C,将B组和S组大鼠背部静置98°C热水中12s后快速擦干,以免烫伤进一步加重。结果造成大鼠背部30%TBSAⅢ度烫伤(后经病理证实)。B组大鼠分别在伤后6h、12h、36h三个时间段,用乳酸林格氏液2ml·/(kg.TBSA),腹腔注射进行烧伤后液体的复苏。S组使用正丁酸钠的剂量为400mg/kg,首先根据每只大鼠的重量,计算出每只大鼠应该使用的正丁酸钠剂量,然后将正丁酸钠用乳酸林格氏液稀释成1:150,腹腔注射进行液体复苏,并以同样的时间点和方式给大鼠含等量正丁酸钠的乳酸林格氏液,进行休克的复苏。所有烧伤后大鼠分别12h、24h和48h经心脏取血后处死,后将大鼠放在固定板上,取出大鼠肠组织,用Western blot及免疫组化的方法检测肠组织中HMGB1,ICAM-1的表达变化规律及转导信号p38MAPK的活化情况。N组大鼠,进行相同的麻醉,用室温水浴模拟烫伤过程不进行液体复苏,但行相同的指标检测。四:研究结果:1.烧伤延迟复苏组大鼠随病程的进展,肠组织中HMGB1的表达逐渐增高,在伤后12h,24h和48h均显著高于正常对照组。而烧伤延迟复苏+正丁酸钠组在烫伤后每个时间相表达均明显低于同时间点的烧伤延迟复苏组。2.正常对照组肠组织上皮细胞和血管内皮细胞表面均有少量染色呈棕黄色,表示ICAM-1的表达呈轻度弱阳性。而烧伤延迟复苏组血管内皮细胞和部分肠组织上皮细胞表面有明显的棕黄色颗粒,说明ICAM-1呈强阳性。烧伤延迟复苏+正丁酸钠组血管内皮细胞及肠组织上皮细胞表面可见少量的棕黄色颗粒,但较烧伤延迟复苏组明显减少。3.用Western blot方法检测肠道p38MAPK的活性,p38 MAPK的活性以p-p38/p38的灰度值比表示,并将正常对照组肠p38MAPK的活性设为1,烧伤延迟复苏组24h,p38MAPK的活性明显升高,为2.17,经HMGB1抑制剂正丁酸钠处理后,烧伤延迟复苏+正丁酸钠治疗组24h大鼠肠道p38MAPK活性较烧伤延迟复苏组24h明显降低,为1.03。4.免疫组化的方法检测肠组织p38MAPK的表达,在正常对照组大鼠的肠组织有散在的阳性蛋白颗粒,而严重烫伤延迟复苏组伤后24h的肠组织的上皮细胞及血管内皮细胞有大量的p38MAPK阳性蛋白颗粒,在烧伤延迟复苏+正丁酸钠24h组,免疫组化法检测肠组织上皮细胞及血管内皮细胞阳性蛋白颗粒明显减少。五、研究结论:大鼠30%TBSAⅢ°烧伤延迟肠损伤发生时,肠道p38MAPK活性显著升高,肠组织粘附分子ICAM-1表达明显增强,使用HMGB1抑制剂正丁酸钠进行干预后上述改变显著减轻,此结果表明:HMGB1通过活化p38MAPK信号转导通路,参与了肠组织粘附分子ICAM-1的产生,由此参与了严重烧伤延迟复苏后急性肠损伤的发生。