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目的本研究首先筛选体外制备弓形虫排泄-分泌抗原(excreted/secreted antigen,ESA)的最适条件,再观察两种不同来源的弓形虫ESA(即Vero细胞体外培养弓形虫获取的ESA和感染鼠腹水中分离的ESA)以及可溶性速殖子抗原(soluble tachyzoite antigen,STAg)鼻内免疫小鼠诱导的黏膜及系统免疫应答及其抗弓形虫感染的能力。探讨三种抗原鼻内免疫诱导的免疫应答及抗感染机制,为弓形虫鼻内复合疫苗的研制奠定理论基础。方法本研究分三部分:第一部分观察弓形虫与Vero细胞不同共培养条件对ESA含量的影响。首先观察不同血清浓度及含血清培养时间对ESA蛋白浓度的影响。按血清浓度0.5%、1%、2%、4%分4组,组内又按含血清培养时间(3h、6h、12h、24h)分4个时间点。弓形虫速殖子与Vero细胞分别在含不同浓度血清的培养基中共培养,并分别于3h、6h、12h或24h后改为无血清培养基继续培养,第7d收集培养上清液并检测蛋白含量。其次观察共培养时间及含血清培养时间对ESA蛋白浓度的影响。按共培养时间(7d、9d、11d、13d)分为4组,组内又按不同的含血清培养时间(12h、24h、48h、72h)分4个时间点。弓形虫速殖子与Vero细胞在含1%血清的培养基中共培养,各组分别于培养12h、24h、48h、72h后改为无血清培养基继续培养,并分别于第7d、9d、11d、13d收集培养上清液,检测蛋白含量。第二部分观察两种不同来源的ESA及STAg鼻内免疫小鼠诱导的黏膜及系统免疫应答。BALB/c小鼠随机分为4组,分别用PBS 20μl/只、体外ESA、腹腔ESA或STAg各20μg/只鼻内免疫2次,间隔14d。分别于末次免疫后14d和44d处死,计数肠上皮内淋巴细胞(intestinal intraepithelial lymphocytes,IEL)和脾淋巴细胞,检测血清IgG和肠液sIgA。第三部分观察两种不同来源的ESA及STAg鼻内免疫小鼠诱导的抗弓形虫作用。BALB/c小鼠随机分为4组,分别用PBS 20μl/只、体外ESA、腹腔ESA和STAg各20μg/只鼻内免疫2次,间隔14d。末次免疫后14d用1×10~4个速殖子/只灌胃攻击,观察小鼠健康状况及体重变化,攻击后30d处死小鼠,计数脾、脑内速殖子。结果弓形虫速殖子与Vero细胞在不同培养条件中共培养,培养基中血清浓度为1%、共培养12h或24h改为无血清培养基所提取的ESA蛋白含量明显高于其它培养条件(P＜0.05)。12h或24h改为无血清培养基并在共培养第13d收集培养上清液获取的ESA蛋白含量显著高于其它时间点(P＜0.001)。体外ESA、腹腔ESA和STAg鼻内免疫小鼠后,腹腔ESA组小鼠状态欠佳,其它各组小鼠健康状况良好。末次免疫后14d,各抗原组脾淋巴细胞(P＜0.05)及IEL(P＜0.01)均增殖活跃,至免疫后44d,两种ESA组脾淋巴细胞数及IEL仍高于PBS组(P＜0.05)。与PBS组比较,各抗原组血清IgG水平在免疫后14d(P＜0.001)和44d(P＜0.05)均明显增高。肠液sIgA水平,体外ESA(P＜0.05)、腹腔ESA(P＜0.001)和STAg(P＜0.001)组在免疫后14d明显高于PBS组,两种ESA组在免疫后44d仍与PBS组有差异(P＜0.05)。体外ESA、腹腔ESA和STAg鼻内免疫小鼠后,腹腔ESA组小鼠出现轻微竖毛、倦怠等异常表现,其它各组小鼠健康状况良好。攻虫后,PBS组小鼠体重逐渐降低,15d后逐渐趋于平缓,而体外ESA组和STAg组(P＜0.05)小鼠体重仍呈增高趋势,腹腔ESA组未见明显升高。各抗原组脾、脑组织内虫荷显著低于PBS组(P＜0.01)。结论弓形虫速殖子与Vero细胞在含1%血清的培养基中共培养12h或24h后,换无血清培养基继续培养,第13d收集培养上清可获得较高含量的弓形虫ESA。体外ESA、腹腔ESA和STAg鼻内免疫均可诱导黏膜及系统的细胞和体液免疫应答,产生抗弓形虫感染的部分保护。体外ESA和腹腔ESA诱导的免疫应答较STAg持久,但腹腔ESA可能对机体有毒副作用,不适宜直接鼻内免疫,体外ESA和STAg符合疫苗设计的安全性及有效性原则,可用于弓形虫黏膜疫苗的研制。