苹果纯合基因型株系再生转化研究及MYB10表达载体构建

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花药培养获得的纯合基因型株系扩大了苹果种质资源,是苹果育种的创新型材料。纯合株系结合基因工程技术手段可以加速育种进程,纯合基因型株系是进行遗传学研究的理想材料。本研究以‘嘎啦’花药培养获得的小孢子来源的40个纯合基因型株系为试验材料进行叶片离体再生培养,筛选挖掘高频再生基因型,并对激素浓度、叶龄、暗培养、接种密度等条件进行了摸索,建立叶片离体培养高效再生体系。基于建立的再生体系,以高频再生基因型DH2-10为转化受体材料,对叶片进行抗生素敏感性测试,筛选材料适宜的抗生素浓度,对转化中菌液浓度、浸染时间、共培养天数和筛选培养时间等条件进行探索,建立农杆菌介导的纯合基因型遗传转化体系,以期为之后的苹果育种及遗传学研究奠定基础。另外从新疆野苹果品种‘舞美’的红色叶片及果皮中克隆MYB10基因,构建表达载体,为苹果MYB10基因的研究做好前期准备。  叶片再生试验结果表明,基因型是纯合基因型株系再生最关键的因素,不同纯合株系再生能力各不一样,其中双单倍体株系DH2-10、DH2-24、DH2-7,四倍体纯合株系DH2-15是再生能力较强的株系,尤以DH2-10为佳。激素对纯合基因型株系再生有很大影响,纯合株系在不同激素水平再生率不同,不同株系最适再生培养激素条件有差异。纯合基因型株系40d叶龄的叶片再生能力更好,暗培养可以促进纯合基因型株系的再生,接种密度对再生没有影响。双单倍体DH2-10在培养基MS+0.5mg/L IBA+5 mg/L 6-BA上可以获得100%的再生率。四倍体纯合株系在培养基MS+0.5mg/L IBA+6 mg/L 6-BA上获得93.33%的再生率。双单倍体DH2-7、DH2-24在培养基MS+0.5mg/L IBA+2mg/L TDZ培养基上分别获得了88.88%和94.44%的再生率。  叶片抗生素敏感性试验表明,高频再生基因型株系DH2-10对卡那霉素(Kan)不敏感,100mg/LKan可完全抑制叶片再生。Cef(Cefotaxime)对DH2-10叶片再生无显著影响,但影响再生芽茎段的伸长生长。特美汀(Timentin)对DH2-10叶片再生几乎无影响。另外Cef与特美汀的协同使用对农杆菌LAB4404有更好的抑制效果,宜使用Cef 600 mg/L+Tim 200mg/L进行转化的脱菌培养。转化试验结果表明,农杆菌介导纯合基因型株系转化时,农杆菌浸染浓度范围宜为0.3~0.7 ,浸染时间以5~10min为佳,共培养时间不超过3天为宜。以Kan100mg/L的选择压进行筛选培养获得了两株抗性芽。  另外,从‘舞美’的红色叶片及果皮中提取RNA进行反转录,设计MYB10基因的特异性引物进行 PCR 扩增,构建了苹果 MYB10 基因表达载体pEZR(k)-LNY-MYB10。
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