论文部分内容阅读
低密度脂蛋白受体相关蛋白5(LRP-5)是低密度脂蛋白受体家族成员之一,该蛋白质属于单跨膜受体,由1615个氨基酸残基组成,分为胞内区、跨膜区、胞外区三个区。LRP-5与其家族中另一个成员LRP-6高度同源。研究表明,LRP-5/LRP-6与七跨膜受体蛋白质FZD共同构成了WNT/β-catenin信号转导通路的受体系统。LRP-5/LRP-6是配体WNTs蛋白质结合的辅受体,当配体WNTs与FZD和LRP-5/LRP-6同时结合时,该信号通路才能被激活。而WNT/β-catenin信号转导通路异常调控与癌症的关系是目前研究的一个热点问题。本研究以WNT/β-catenin信号通路中辅受体LRP-5为切入点,应用RNAi技术沉默LRP-5基因表达,探讨WNT/β-catenin信号转导通路改变对胃癌细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移等生物学行为及差异蛋白质组学的影响,以期探讨胃癌发病机制,为胃癌治疗的可能药物靶点提供实验依据。首先,用qRT-PCR和免疫组化的方法检测了不同分化程度的胃癌组织中LRP-5基因的表达状态,为下一步开展RNAi实验奠定可行性基础研究。结果显示,中分化、低分化的胃癌组织中LRP-5高表达,与正常胃组织比较差异有统计学意义(P﹤0.05),而且伴有淋巴细胞转移的胃癌组织中也呈现LRP-5高表达。这提示LRP-5与胃癌的发生、发展、转移和恶性程度相关。其次,构建了4个针对LRP-5基因不同位点的pGPU6/GFP/Neo-LRP-5干扰质粒,进行转染效率和干扰效率的评价后,成功筛选出了pGPU6/GFP/Neo-LRP-5-Homo-4868(L68)干扰质粒。经瞬时转染48h沉默MGC-803中LRP-5基因表达后,观察其对细胞增殖、粘附、凋亡、周期、侵袭、迁移的影响。结果显示:1、CCK8法检测,LRP-5基因干扰组转染MGC-803细胞48h,相对生长速度显著低于空白对照组和阴性对照组(P<0.05);2、LRP-5基因干扰组MGC-803细胞的粘附细胞数为155.00±18.33,较空白对照组和阴性对照组升高,差异有统计学意义(P<0.05);3、流式细胞仪双染法检测细胞凋亡,在LRP-5干扰质粒转染MGC-803细胞48h后,活细胞数量减少、凋亡细胞增多,与阴性对照组比较差异有统计学意义(P﹤0.05);4、流式细胞仪PI单染检测细胞周期,在LRP-5干扰质粒转染MGC-803细胞48h后,LRP-5干扰组的S期比例升高、G2期比例降低,发生了S期阻滞现象;5、Transwell小室基底膜实验表明,LRP-5干扰组侵袭迁移到Transwell基底膜下层的细胞计数为(38.67±3.51),与空白对照组(52.67±4.51)、Mock组(50.67±3.79)、阴性对照组(47.00±4.36)比较,细胞的侵袭能力有所下降,差异有统计学意义(P﹤0.05);6、划痕实验显示,LRP-5干扰组MGC-803细胞的迁移愈合率为0.7509±0.0108,与空白对照组和阴性对照组比较,愈合率下降,迁移能力下降,差异有统计学意义(P<0.05)。最后,本研究采用RNAi技术沉默人胃癌MGC-803细胞中LRP-5基因表达,在转染MGC-803细胞48h后,抽提干扰组和阴性对照组细胞总蛋白。应用2D电泳分离纯化蛋白质、PDQuest软件分析2D电泳胶图,结果显示,两组之间共有29个差异蛋白质点。选择其中15个点进行质谱鉴定,成功12个。与阴性对照组比较,L68干扰组中有10个点上调,2个点下调。这些蛋白质包括:细胞骨架、分子伴侣、细胞周期、细胞增殖、糖代谢相关的蛋白质。本研究首次应用RNAi技术沉默LRP-5基因,对胃癌MGC-803细胞的生物学行为及差异蛋白质的影响进行深入研究,初步发现了LRP-5的低表达可抑制胃癌MGC-803细胞的增殖、迁移和侵袭,为探讨胃癌发病机制和开发胃癌治疗的可能药物靶点提供了实验依据。