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蛋白酪氨酸激酶（protein tyrosine kinase,PTK）是参与调节细胞增殖和死亡相关信号转导的关键激酶。根据其结构,可以分为受体酪氨酸激酶（receptor PTK,RTK）和非受体酪氨酸激酶（non-receptor PTK,NRTK）两类。RTK主要包括血小板源性生长因子受体（platelet-derived growth factor receptor,PDGFR）、表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor,EGFR）、成纤维生长因子受体（fibroblast growth factor receptor,FGFR）、原肌球蛋白受体激酶（tropomyosin receptor kinase,TRK）等;NRTK是传递胞内信号的胞质蛋白,可以与细胞膜结合或具有核特异性,主要包括脾酪氨酸激酶（spleen tyrosine kinase,Syk）、在肝癌中表达的酪氨酸激酶（tyrosine kinase expressed in hepatocellular carcinoma,TEC）和粘附斑激酶（focal adhesion kinase,FAK）等激酶家族。PTK的异常表达通常导致肿瘤的发生、发展,因此,PTK已经成为抗肿瘤治疗的重要靶点。酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitors,TKIs）与PTK的ATP结合位点竞争性结合,已在肿瘤治疗方面取得了很大进展,但获得性耐药的产生限制了其疗效。本论文主要开展了针对突变型TRK的第二代TRK小分子抑制剂ASD-098的抗肿瘤活性及机制研究。同时针对BTK抑制剂耐药的细胞,重点探索了其产生获得性耐药的分子机制和应对策略。TRK家族是典型的受体酪氨酸激酶,包括TRKA、TRKB和TRKC三个成员,分别由NTRK1、NTRK2、NTRK3基因编码。正常生理条件下,TRK充当神经营养蛋白的高亲和力受体,在神经元的生长和发育中起重要作用,但NTRK突变或重排而导致TRK异常激活是恶性肿瘤的驱动力之一。第二代TRK小分子抑制剂是对突变型NTRK亚型具有更高活性的新一代抑制剂,能够有效克服由激酶结构域突变介导的获得性耐药。目前国际上主要有LOXO-195和TPX-0005两个第二代TRK抑制剂成功上市,且仅有LOXO-195选择性抑制TRK活性。因此,为了研发具有我国自主知识产权的第二代选择性TRK抑制剂,我们评价了新型小分子TRK抑制剂ASD-098的药理学活性。激酶测试结果显示ASD-098是一个高效的TRK抑制剂,显著抑制非突变型及耐药突变型TRK活性;对耐药突变激酶的抑制活性比LOXO-195强1～4倍,比第一代抑制剂LOXO-101至少强10～40倍,并且其代谢产物ASD-097对TRK同样有明显抑制活性。细胞增殖抑制实验表明ASD-098选择性地抑制非突变型和突变型TRK融合蛋白阳性细胞的增殖,在高表达非突变型TRKA/B/C融合蛋白的Ba/F3细胞中,ASD-098抑制细胞增殖的IC50<0.3 n M,强于LOXO-101和Etrectinib;更重要的是,ASD-098同样显著抑制高表达突变型TRK融合蛋白阳性细胞增殖,如表达TPM3-TRKA G595R、LMNA-TRKA G667C和ETV6-TRKC G623R的Ba/F3细胞,活性比LOXO-195强3～4倍。此外,ASD-098抑制TRK及其介导的下游ERK1/2磷酸化、诱导细胞G0/G1期阻滞和细胞凋亡。体内抗肿瘤药效实验发现ASD-098通过抑制TRK-ERK1/2信号通路而显著抑制裸小鼠皮下移植瘤生长,对非突变型TRK融合蛋白阳性肿瘤如AFAP1-TRKB WT及突变型TRK融合蛋白阳性肿瘤如TPM3-TRKA G595R、ETV6-TRKC G623R均有显著疗效,而没有明显毒性;ASD-098同时具有良好的药代动力学特性,在肿瘤组织中,比LOXO-195有更高暴露水平和吸收速率,且消除更慢。以上结果说明ASD-098是一个高效的第二代TRK抑制剂,可用于克服临床上突变型NTRK融合基因产生的耐药。布鲁顿酪氨酸激酶（Bruton’s tyrosine kinase,BTK）属于非受体酪氨酸激酶TEC家族,是BCR信号通路中的关键成分,对许多B细胞来源恶性肿瘤细胞增殖和存活至关重要,因此,BTK是一个重要的抗肿瘤靶点。BTK抑制剂伊鲁替尼（ibrutinib）是一种ATP竞争性抑制剂,与BTK的ATP结合位点的Cys481共价结合,已经上市,用于治疗慢性淋巴细胞白血病（chronic lymphocytic leukemia,CLL）、套细胞淋巴瘤（mantle cell lymphoma,MCL）和华氏巨球蛋白血症（Waldenstroms macroglobulinemia,WM）等,但几乎有三分之一的患者对ibrutinib存在原发性固有耐药,而其他患者应用ibrutinib后出现获得性耐药。因此,研究ibrutinib耐药机制并寻找有效策略克服ibrutinib耐药十分重要。弥漫性大B细胞淋巴瘤DOHH-2经过ibrutinib长期处理产生了对ibrutinib耐药,该耐药细胞株命名为DOHH2/Ibru-2。在DOHH2/Ibru-2细胞中,没有发现BTK缺失和突变,但m TOR和AKT高激活;进一步研究发现PI3K/m TOR抑制剂BKM120选择性抑制DOHH2/Ibru-2细胞中AKT和m TOR磷酸化,并且联用BKM120和ibrutinib能够克服m TOR和AKT高激活引起的耐药。另外,在稳定表达BTK C481S对ibrutinib耐药的32D细胞中也证实联用BTK抑制剂和PI3K/m TOR抑制剂可以克服点突变引起的获得性耐药。综上所述,ASD-098是一个新型高效的第二代TRK小分子抑制剂,在克服NTRK突变引起的获得性耐药治疗中具有广阔前景;另外,对于BTK抑制剂耐药患者,联合抑制BTK和PI3K/m TOR信号通路可能是克服ibrutinib耐药的有效策略。