海洋真菌Cladosporium Sphaerospermum的筛选及次级代谢产物研究

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从微生物资源中分离活性天然产物是药物开发的一个重要领域,长期以来,科研工作者把从微生物中发掘新的天然产物的注意力集中在陆生微生物资源上,绝大部分可培养的陆地微生物都已经被研究。随着陆生微生物菌株活性代谢物质的不断发掘与利用,活性菌株和活性代谢产物的研究工作重复率越来越高,不仅造成了人力、物力资源的极度浪费,而且从陆上微生物中获取新种属的微生物以及新型活性代谢产物的难度也越来越大。生活于深海的海洋微生物处于独特的物理、化学和生态环境中,在高静水压,剧变的温度梯度、极微弱的光照条件下,它们形成了极为特殊的生物结构、代谢机制系统。由于这种极端的环境,可能导致深海微生物产生结构新颖、活性独特的代谢产物,具有巨大的研究和应用价值,可为新药开发提供优异的种质资源。  目的:从南海深海沉积物中筛选出代谢产物丰富并有抗植物病原菌、抗肿瘤活性的目标菌株,并研究目标菌株海洋真菌球孢枝孢菌(Cladosprium sp.FS86)次级代谢产物。  方法:通过对南海深海沉积物中海洋真菌的分离和纯化,发酵培养获得发酵液粗提物和菌丝体粗提物,进行抗肿瘤活性试验、抗植物病原真菌活性试验以及薄层层析(TLC)等实验,筛选出目标菌株并鉴定菌种。将目标菌株球孢枝孢菌(Cladosprium sp.FS86)经PDB液体培养基进行大规模发酵培养获得发酵液粗提物和菌丝体粗提物,经正相硅胶柱、反相硅胶柱C18、Sephadex LH-20凝胶柱、制备薄层、高效液相色谱、重结晶等各种化学分离方法分离纯化化合物,并通过理化常数测定及各种波谱技术(1H-NMR、13C-NMR、EI-MS、HR-ESI-MS、1H-1H COSY、HSQC、HMBC等)对分离纯化的化合物进行结构鉴定;以链格孢霉、新月弯孢霉、霜疫霉、柱枝双孢霉、胶孢炭疽霉作为供试菌株,采用生长对峙法对所得部分化合物进行体外抗植物病原真菌活性研究;以神经胶质瘤细胞SF-268、乳腺癌细胞MCF-7、非小细胞肺癌细胞株NCI-H460、肝癌细胞HePG-2为供试细胞株,采用SRB染色法对所得部分化合物进行体外细胞毒活性研究。  结果:菌株 FS86的代谢产物中蕴含着较为丰富的化合物类型,并且具有较好的抗肿瘤和抗植物病原真菌的活性,经鉴定目标菌株 FS86为 Cladosporium sphaerospermum。从其发酵液粗提物中分离到30个化合物,经波谱数据分析和样品对照共鉴定出其中19化合物,分别为:2-甲基-十一烷(1)、苯甲酸(2)、1-氯苯基-3-甲基-3-苯基-1-丁烯(3)、联苯铵盐(4)、4-氯-苯甲醛-顺-肟(5)、(E)-2-甲基-6-苯乙烯基-四氢化吡喃(6)、2-乙基-3-甲基-喹啉(7)、(Z、E) N-乙酰基-丙酰胺(8)、环-L-脯氨酸-L-异亮氨酸-L-脯氨酸-L-亮氨酸(9)、环-L-脯氨酸-L-缬氨酸(10)、2-叔丁基-喹啉(11)、2-氨基-苯磺酸(12)、3-(2-苯乙基)-苯胺(13)、1,3-bis-(4-chloro-phenyl)-3-methyl-triazene(14)、N,N-dimethyl-4-[(1-butyl amino-1-cyclopentyl)-methyl]-aniline(15)、3-溴丙基-苯次磷酸(16)、diphenyl-(3-methyl butanyl)-phosphine-oxide(17)、(s)-(+)-2-amino-4-methyl-pentan phosphonic acid-diethylester(18)、4-苯基-1,2,3-噻二唑-3-氧化物(19)。在100μmoL/L浓度下,化合物10对SF-268、MCF-7、NCI-H460、HePG-2细胞株的抑制率分别为90.60%、74.48%、87.04%、87.23%,IC50分别为29.07、6.26、14.13、28.61μM。在样品浓度为10ug/disk时,化合物2对胶孢炭疽菌的抑制率为87%;化合物4和5对荔枝霜疫霉的抑制率均为53.7%;化合物6对柱枝双胞霉的抑制率为85.5%;化合物7对柱枝双胞霉、胶孢炭疽菌的抑制率非别为71.4%、50.8%;化合物8柱枝双胞霉、胶孢炭疽菌的抑制率非别为66.1%、55.1;化合物9对胶孢炭疽菌的抑制率为73.9%;化合物10对新月弯孢霉、荔枝霜疫霉、柱枝双胞霉的抑制率分别为63.2%、61%、66.1%。  结论:目标菌株FS86为Cladosporium sphaerospermum。化合物4~6、9~11、13~19均为首次从该属真菌中分离得到。化合物10有一定抗肿瘤活性;化合物2、4、5、6、7、8、9、10有一定抗菌活性。
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