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本论文将复杂蛋白质混合样品中目标蛋白的分离纯化抽象为双组分和三组分混合蛋白样品的分离纯化过程,以双组分和三组分蛋白质混合物中目标蛋白的离子交换柱层析分离纯化过程为研究对象,探讨了目标蛋白在层析柱上的分离纯化策略,并以从猪全血中分离纯化高纯度猪血红蛋白和从戊二醛聚合猪血红蛋白中去除低分子量血红蛋白的分离纯化策略为例,验证了本文提出的分离纯化策略,为中试和规模化分离纯化目标蛋白提供了高效和可行的解决方案。在双组分混合样品的分离纯化策略研究中,以猪血红蛋白和溶菌酶在CM SepharoseFast-Flow阳离子交换层析上的分离纯化过程为例,研究了它们的分离纯化策略。对于图谱类型Ⅰ,主要根据层析介质有效柱容量采用流穿模式进行洗脱,使少量蛋白达到浓缩富集的目的。对于图谱类型Ⅱ,主要采用吸附模式进行步级梯度洗脱方式进行:在三组分混合样品的分离纯化策略研究中,以猪血红蛋白、溶菌酶和胰蛋白酶在SP SepharoseFast-Flow强阳离子交换层析上的分离纯化过程为例,研究了它们的分离纯化策略。对三组分混合物的分离纯化过程,可以归纳为三种分离纯化策略:纯化策略Ⅰ:采用一步流穿模式纯化;纯化策略Ⅱ:采用步级梯度洗脱纯化;纯化策略Ⅲ:采用两步流穿模式纯化。采用以上分离纯化策略得到的猪血红蛋白和溶菌酶经凝胶排阻高效液相色谱(SEC-HPLC)检测纯度均达到99.9%以上,离子交换高效液相色谱(IEX-HPLC)检测纯度均达到95%以上,回收率都在93%以上,且目标产物均可不同程度的浓缩。通过经济效益分析,新的纯化策略比传统纯化策略产量均高出10倍以上,缩短了单次纯化时间并扩大了单位时间的产量。在从猪全血中纯化高纯度猪血红蛋白的分离纯化策略研究中,通过对缓冲体系种类、缓冲体系pH值、盐离子强度、动态柱容量等条件的优化,以及对比吸附模式和流穿模式分离纯化结果的分析,最终选择DEAE Sepharose Fast-Flow阴离子交换层析介质为固定相,以20.0 mmol/L磷酸缓冲液+0.16 mol/L NaCl(pH8.0)上样流穿洗脱至杂质饱和层析柱后,再以20.0 mmol/L磷酸缓冲液+1.0 mol/L NaCl(pH8.0)洗脱杂质。纯化后的Hb经TSK-GEL G3000SWXL检测纯度99.99%,Shim-Pack WAX-1检测纯度为97.86%,SDS-PAGE检测达到电泳纯,并未检测出磷脂酰丝氨酸和磷脂酰乙醇胺,全部指标均达到美国FDA对基于血红蛋白的红细胞代用品的原料质量标准。在从戊二醛聚合猪血红蛋白中去除低分子量血红蛋白的分离纯化策略研究中,分别对它们在Sephadex G-75凝胶排阻层析、排阻限为10 kD的中空纤维柱超滤和DEAESepharose Fast-Flow阴离子交换层析三种纯化方法上的工艺路线进行了对比,最终选择了DEAE Sepharose Fast-Flow阴离子交换层析。优化后的层析分离纯化条件为:以20.0mmol/L PB+0.06 mol/L NaCl(pH7.3)作为平衡缓冲液,以NaCl溶液进行线性梯度洗脱,最后再以20.0 mmol/L PB+1.0 tool/L NaCl(pH7.3)进行洗脱。纯化后的聚合体血红蛋白经凝胶排阻色谱和多角度激光散射仪联用检测64 kD以下分子量血红蛋白含量小于5%,符合本实验室质量控制标准。