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目的:我们前期的研究发现,胶质瘤高表达癌-睾丸抗原OY-TES-1并与p53表达相关。本研究拟了解胶质瘤中p53对OY-TES-1表达的影响,了解p53作为转录因子对OY-TES-1启动子的转录调控作用,为初步阐明胶质瘤中OY-TES-1的表达机制提供实验依据。方法:（1）构建和验证不同p53状态的胶质瘤细胞模型:首先,选取野生型p53(p53Wt)的胶质瘤细胞系（U87MG,A172）,运用CRISPR-Cas9基因编辑技术,敲除细胞中的p53Wt基因,构建p53基因缺失的细胞模型(U87MG-p53ko,A172-p53ko);然后,构建两种常见的p53突变位点(p53Mt175、p53Mt248)的慢病毒载体(Lv-p53Mt175和Lv-p53Mt248),将其分别转入p53 ko胶质瘤细胞系,构建p53突变的胶质瘤细胞模型(U87MG-p53Mt175和U87MG-p53Mt248;A172-p53Mt175和A172-p53Mt248)。运用q RT-PCR和Western Blot技术,从m RNA和蛋白水平检测p53,并检测p53的下游靶基因p21蛋白水平,评估p53缺失/突变的胶质瘤细胞模型是否构建成功。（2）检测不同p53状态细胞的OY-TES-1的表达:运用q RT-PCR和Western Blot方法,分别从RNA和蛋白水平检测在p53Wt胶质瘤细胞系、p53ko胶质瘤细胞系和p53Mt胶质瘤细胞系中OY-TES-1的表达情况。（3）预测OY-TES-1启动子上的转录因子结合位点:使用两个转录因子在线预测工具（Mat Inspector、PROMO）,对先前课题组已确认的OY-TES-1核心启动子区域（-184至+66NT）进行预测,寻找潜在的转录因子结合位点。（4）设计与构建OY-TES-1核心启动子报告基因载体:将OY-TES-1核心启动子序列（-184至+66NT）,以及p53结合位点突变的OY-TES-1核心启动子序列分别插入pGL3-Basic载体上Kpn I和Hind III酶切位点,构建以下pGL3重组质粒:OY-TES-1核心启动子重组质粒（pGL3-OY）,p53结合位点1突变的OY-TES-1核心启动子重组质粒（pGL3-OY-M1）、p53结合位点2突变的OY-TES-1核心启动子重组质粒（pGL3-OY-M2）及p53结合位点全部突变的OY-TES-1核心启动子重组质粒（pGL3-OY-M3）。（5）荧光素酶实验（Luciferase assay）:将构建好的pGL3重组质粒,用Lipofectamine（?）2000试剂转染细胞。该实验分为两部分:一是将pGL3-OY分别转入p53Wt细胞、p53ko细胞和p53Mt细胞,检测荧光素酶活性,了解不同状态p53对OY-TES-1启动子活性的影响;二是将pGL3-OY、pGL3-OY-M1、pGL3-OY-M2和pGL3-OY-M3分别转染p53Wt细胞,检测荧光素酶活性,了解OY-TES-1启动子活性是否与其上的p53结合位点的突变有关。（6）染色质免疫共沉淀-q PCR（Chromatin-immunoprecipitation-q PCR,Ch IP-q PCR）实验验证p53与OY-TES-1启动子的结合:提取不同p53状态的胶质瘤细胞系的核提取物,将核提取物与p53抗体共孵育,使p53蛋白结合的DNA片段得到明显富集,纯化沉淀物,通过q-PCR扩增OY-TES-1启动子片段,验证p53与OY-TES-1启动子的结合。结果:（1）成功构建p53缺失型/突变型胶质瘤细胞系:q RT-PCR和Western Blot检测p53ko细胞,结果显示p53 m RNA几乎检测不到或阴性,p53蛋白为阴性,p21蛋白水平也呈现明显下调,该结果说明p53基因已敲除。p53Mt细胞的检测结果显示,p53 m RNA和蛋白均为阳性,提示已成功构建了p53突变型胶质瘤细胞系。（2）p53影响OY-TES-1的表达:q RT-PCR结果显示:p53Wt细胞中OY-TES-1 m RNA下调,而p53ko和p53Mt细胞中OY-TES-1 m RNA的表达上调,p53Wt细胞的OY-TES-1 m RNA表达水平与p53ko和p53Mt细胞OY-TES-1 m RNA比较具有统计学意义;Western Blot结果显示:与p53ko和p53Mt胶质瘤细胞比较,p53Wt细胞中的OY-TES-1蛋白明显降低,其差异具有统计学意义。这一结果提示野生型p53抑制OY-TES-1 m RNA和蛋白的表达,p53缺失和突变增强OY-TES-1 m RNA和蛋白的表达（3）OY-TES-1核心启动子区含两个p53结合位点:应用在线转录因子预测软件对OY-TES-1的核心启动子区进行分析,结果显示,在该区域有两个p53结合位点,其中一个p53结合位点与Sp1结合位点重叠,这一结果提示p53有可能作为转录因子调控OY-TES-1的转录。（4）成功构建OY-TES-1核心启动子报告基因载体:将构建好的pGL3-重组质粒（pGL3-OY、pGL3-OY-M1、pGL3-OY-M2和pGL3-OY-M3）进行DNA测序,blast比对测序结果,结果表明与Genbank中序列完全吻合,证实载体构建成功。（5）p53影响OY-TES-1启动子活性:首先,将pGL3-OY转入不同p53状态(p53Wt、p53ko和p53Mt)的细胞,测荧光素酶活性,结果显示:与pGL3-Basic组相比,p53Wt细胞的荧光素酶活性降低,这一结果提示OY-TES-1启动子活性可被野生型p53抑制;其次,分别将pGL3-OY、pGL3-OY-M1、pGL3-OY-M2和pGL3-OY-M3转染p53Wt细胞,荧光素酶实验结果表明:与pGL3-OY组相比,pGL3-OY-M1、pGL3-OY-M2和pGL3-OY-M3组,除U87MG细胞转染pGL3-OY-M1后呈现荧光素酶活性降低外,其余细胞的荧光素酶活性均明显升高,这一结果说明在大多数情况下OY-TES-1核心启动子上的p53结合位点突变会使启动子活性升高。（6）OY-TES-1可能是p53的靶基因:Ch IP-q PCR检测显示,p53Wt能与OY-TES-1启动子结合;对于突变的p53,p53Mt175不能与OY-TES-1启动子结合;p53Mt248则在不同的细胞其与OY-TES-1启动子结合的情况不同,在U87MG细胞系中,p53Mt248不能与OY-TES-1启动子结合;而在A172细胞系中,p53Mt248能与OY-TES-1启动子结合,不同状态p53对OY-TES-1启动子富集情况不同。结论:在胶质瘤中p53作为转录因子参与了OY-TES-1的转录激活。