蛋白质去泛素化是指由去泛素化酶水解泛素和蛋白质之间的硫酯键,进而移除底物上泛素分子的过程,从而保护底物不被蛋白酶体水解或者调控底物的亚细胞定位或活性。USP7是一个泛素特异性蛋白酶家族的成员,属于半胱氨酸蛋白酶类去泛素化酶。USP7能够调节细胞内许多蛋白底物的表达和活性,并在肿瘤的发生发展中起重要作用。但USP7在胃癌中的作用机制尚不明确,需进一步研究。MDM2是USP7的底物之一,同时还是一种致癌蛋白和E3连接酶,它促进了肿瘤抑制因子p53的降解,因此本课题第一部分旨在建立基于USP7与MDM2相互作用的抑制剂筛选方法,以期筛选出能够阻断USP7-MDM2相互作用的抑制剂,从而降低MDM2蛋白表达,进而使得细胞内p53的水平升高,最终达到抑制肿瘤的作用。另外,作为重要的肿瘤靶点,LSD1也是USP7的众多底物之一,USP7可以对LSD1起稳定作用,因此本课题的第二部分围绕USP7对LSD1的调控机制进行探索。本课题的主要研究内容包括:(1)基于组织芯片技术以及相关数据库的USP7相关蛋白的发现本课题通过组织芯片联合免疫组化实验结果分析发现,USP7在癌组织中的表达明显高于癌旁组织。进而通过Kaplan Meier生存分析网站分别分析发现,USP7或MDM2高表达的胃癌患者生存期明显比低表达患者短。并且在胃癌组织中,USP7与LSD1表达量存在极显著的正相关性(r=0.302,p<0.0001)。最后利用BioGRID 3.5数据库,发现USP7与LSD1可发生蛋白质相互作用。(2)基于USP7与MDM2相互作用的小分子抑制剂筛选方法的建立分别构建USP7的N端与MDM2原核表达载体,采用亲和层析技术分别对蛋白进行纯化,得到了纯度较高的截短体USP7与MDM2重组蛋白。利用HTRF技术成功建立USP7与MDM2相互作用抑制剂筛选方法。(3)USP7对LSD1调控机制的研究本课题发现USP7表达量在AR高表达的胃癌组织中与LSD1表达量高度正相关(r=0.394,p=0.0001)。细胞水平研究发现,USP7可与LSD1的Tower与AOL结构域相互作用,并在胃癌细胞中以浓度依赖性的方式维持LSD1的稳定性。进一步的机制研究表明,USP7可通过去除LSD1的多聚泛素化显著延长LSD1的半衰期。最终确认USP7可在胃癌细胞中以AR依赖性的形式去除LSD1泛素化,维持LSD1稳定性。综上所述,本课题首次建立了基于HTRF技术的USP7-MDM2相互作用抑制剂筛选方法。发现胃癌细胞中USP7是可以AR依赖的方式调节LSD1,维持LSD1稳定性。该发现对未来胃癌患者的临床治疗的选择性和针对性具有重大意义。