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研究背景 抑郁症(Depression)是一种神经免疫性疾病,其主要临床表现为持久性情绪低落和思维迟缓。中枢神经炎症是抑郁症主要的病理改变。研究发现,在中枢神经炎症性疾病中,一些关键蛋白的异常糖基化能够影响机体免疫调控和疾病预后。蛋白质糖基化是一种重要的蛋白翻译后修饰,功能包括维持蛋白质的结构功能、参与细胞粘附及信号转导。糖基化失调可导致糖链结构和数量紊乱,改变糖蛋白生物学功能。蛋白质的岩藻糖基化和唾液酸化修饰普遍存在于生物体内是糖基化的比较常见的类型。α1,6-岩藻糖基转移酶(α1,6-fucosyltransferase,Fut8)是参与核心岩藻糖基化的唯一酶类。β半乳糖苷α2,6-唾液酸转移酶(β-galactosideα2,6-sialyltranferase 1,ST6GAL1)催化末端α2,6-唾液酸连接于N-糖链上,参与唾液酸化修饰。已有研究表明,岩藻糖基化和唾液酸化与组织炎症微环境的形成有关。类风湿性关节炎和骨性关节炎滑膜组织中Fut8表达增高,岩藻糖基化和唾液酸化增强。此外,在长期处于应激状态的精神分裂症患者血清中,岩藻糖基化和唾液酸化也增强。小胶质细胞是中枢神经系统的常驻免疫细胞,激活的小胶质细胞是脑内炎性因子的主要来源。但是,抑郁症外周和中枢炎症反应增强的同时,血清、脑组织蛋白和小胶质细胞是否发生岩藻糖基化和唾液酸基化改变,以及相关的糖基转移酶如何变化,目前未见相关报道。研究目的 探讨蛋白糖基化在炎性抑郁症模型小鼠血清及脑组织中的改变,明确在抑郁症免疫激活状态下外周及中枢神经系统中蛋白糖基化的改变特征,为抑郁症发病机制的研究提供新的角度和资料。研究方法 脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)腹腔注射建立炎性抑郁小鼠模型,旷场实验(open field test,OFT)、高架十字迷宫实验(elevated plus-maze,EPM)、强迫游泳实验(forced swimming test,FST)以及悬尾实验(tail suspension test,TST)检测小鼠行为学变化;质谱技术用于检测血清中的糖基化的改变;凝集素印迹检测岩藻糖基化和唾液酸化水平;体外培养小鼠原代小胶质细胞和BV2小胶质细胞株;RT-q PCR和ELISA实验用于检测血清、脑和小胶质细胞中肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)以及白介素-6(interleukin-6,IL-6)表达;ELISA方法检测Fut8和ST6GAL1的表达。结果 1.LPS腹腔注射建立抑郁小鼠模型与对照组比较,LPS(1 mg/kg)注射24 h后小鼠在OFT实验中心区域的活动时间显著下降(p<0.001),在EPM实验中小鼠在开放臂活动的时间明显减少(p<0.001),TST和FST实验中小鼠的不动静止时间较control组均有显著上调(p<0.05),上述行为学结果表明LPS腹腔注射成功诱导建立抑郁动物模型。2.抑郁模型小鼠血清蛋白糖基化改变特征(1)抑郁模型小鼠出现外周炎症反应ELISA方法检测结果显示,LPS注射24 h后小鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-α的表达水平均有显著升高(p<0.05)。(2)抑郁模型小鼠血清中岩藻糖基化和唾液酸化水平上调质谱分析结果显示,LPS注射小鼠血清N-糖中岩藻糖基化和唾液酸化水平明显上调(p<0.0001)。凝集素染色结果显示,LPS注射组血清α1,6连接的岩藻糖残基和末端岩藻糖残基,α2,6连接的唾液酸残基较对照组均有显著增加(p<0.001)(3)抑郁模型小鼠血清中岩藻糖转移酶和唾液酸转移酶表达增加ELISA方法检测血清及肝脏中Fut8和ST6GAL1的水平。结果发现,LPS注射组小鼠血清及肝脏中Fut8和ST6GAL1水平较对照组均有明显上调(p<0.05)。3.抑郁模型小鼠脑内糖基化改变特征(1)抑郁模型小鼠脑内促炎性细胞因子表达上调RT-q PCR和ELISA结果显示,LPS注射24 h后,IL-1β、IL-6和TNF-α蛋白水平和m RNA水平的表达均出现显著增加(p<0.01)。(2)抑郁模型小鼠脑组织蛋白岩藻糖基化和唾液酸化水平上调凝集素染色结果显示,LPS注射组小鼠的脑组织蛋白岩藻糖基化和唾液酸化水平均有明显增强(p<0.05)。(3)抑郁模型小鼠脑中糖基转移酶的改变ELISA实验结果显示,LPS注射组脑组织蛋白中Fut8表达较对照组明显增强(p<0.01)。同样,ST6GAL1水平较对照组也出现明显增高(p<0.0001)。4.免疫激活的小胶质细胞糖基化改变特征(1)LPS刺激小胶质细胞引起炎性因子表达增强在原代培养的小胶质细胞和BV2小胶质细胞株的培养液中,分别加入LPS(100 ng/m L)孵育。RT-q PCR检测结果显示,LPS孵育24 h后,原代小胶质细胞和BV2细胞IL-1β、TNF-α和IL-6的基因表达水平较对照组显著增加(p<0.01)。(2)LPS刺激小胶质细胞引起蛋白糖基化水平增强凝集素染色结果显示,LPS(100 ng/m L)刺激24 h后小胶质细胞蛋白岩藻糖基化和唾液酸化的水平较未刺激组明显升高(p<0.05)。(3)LPS刺激小胶质细胞导致糖基转移酶的表达上调ELISA检测结果发现,LPS(100 ng/m L)刺激24 h后,在原代小胶质细胞和BV2细胞中,ST6GAL1和Fut8的蛋白表达水平较control组均有显著升高(p<0.05)。结论 1.炎性抑郁小鼠模型的外周及中枢神经系统炎症反应增强且伴随糖基转移酶及糖基化水平的增加。2.脑内炎症反应可能与免疫激活的小胶质细胞糖基转移酶及糖基化水平增高有关。