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目的：
正常的屈光发育需要正确的视觉信号的引导，它包括视网膜信号转导，脉络膜信号调控及巩膜重塑，其中电耦联是视网膜信号转导的重要组成部分，而构成电耦联的缝隙连接蛋白在视网膜上广泛分布，并参与视网膜的横向和纵向信号转导。本实验室前期试验发现，视网膜缝隙连接参与豚鼠近视的发生发展。所以本课题拟明确视网膜水平细胞间由Cx57构成的缝隙连接，及主要参与视杆通路的Cx36形成的缝隙连接在形觉剥夺性近视中的改变。
方法：
1、形觉剥夺对生物素在水平细胞间扩散范围的影响。
研究视网膜水平细胞缝隙连接开放水平在形觉剥夺性近视中的改变，并进一步探索空间频率及光照在其中的作用，研究空间频率采用了空间频率剥夺模型及离焦诱导近豚鼠模型，以明确形觉剥夺引起的水平细胞间电耦联开放水平的改变是由于光照水平变化还是由于空间频率剥夺引起。
本实验筛选屈光度在+3-+8Diopter(D)，双眼屈光参差＜2D的3周龄三色豚鼠，雌雄不限。随机分为（1）正常视觉环境组(Normalvision，NV)和形觉剥夺组(Formdeprivation，FD，右眼单眼剥夺)；（2）负镜片诱导组（右眼佩戴-4.00D镜片）和平光组（0.00D）；（3）空间频率剥夺组（灰色视标组，gray组；黑白条纹组，Black/Whitegrating组,B/Wgrating组）；（4）正常300Lux视觉环境组（300Lux）和模拟形觉剥夺的40Lux视觉环境组（40Lux）。
2、缝隙连接非选择性拮抗剂18-β-甘草次酸（18-β-Glycyrrhetinicacid，18-β-GA）对生物素在水平细胞间扩散范围的影响。
豚鼠随机分为溶剂对照组(二甲基亚砜，DMSO；NV+V)，18-β-GA组(NV+18-β-GA)。每天球旁注射DMSO或者18-β-GA100μl，两天后，在明适应条件下，利用Cut-loading技术检测生物素在水平细胞间的扩散范围。
3、形觉剥夺对缝隙连接蛋白Cx36的表达及其磷酸化水平的影响。
形觉剥夺4周，利用免疫荧光（Immunofluorescence,IF）方法，检测缝隙连接蛋白Cx36（connexin36）及其磷酸化（p-Cx36）斑块的面积、荧光强度、个数等参数进行定量分析。
4、缝隙连接非选择性拮抗剂18-β-甘草次酸，对连接蛋白Cx36的表达及其磷酸化水平的影响。
动物随机分为溶剂对照组(NV+V)，18-β-GA组(NV+18-β-GA)。每天球旁注射DMSO或者18-β-GA100μl，4周后，利用免疫荧光方法，检测缝隙连接蛋白Cx36及其磷酸化水平。
结果：
1、利用Cut-loading技术处理各组视网膜，观察各组示踪剂扩散情况。根据扩散公式，得到空间常数λ值，λ值越大则表明扩散范围越大，缝隙连接的开放程度越大，本实验研究水平细胞层，遂λ值的大小反映了水平细胞间缝隙连接的开放程度。
（1）形觉剥夺2天，FD组相比NV组，空间常数λ值明显增大，即形觉剥夺促进水平细胞间缝隙连接的开放。（2）镜片诱导2天组，0.00D组与-4.00D相比，λ值无明显变化，即离焦诱导近视对水平细胞间缝隙连接的开放程度无明显影响。（3）空间频率剥夺3周，黑白条纹视标组与灰色视标组相比,空间常数λ值也无明显变化。（4）暗适应40Lux与正常300Lux组相比，空间常数λ值明显降低。
2、正常视觉环境下,注射18-β-GA2天。
明适应环境下，NV组与NV+V组相比，λ值无明显变化，表明注射溶剂对水平细胞间的缝隙连接开放程度无明显影响。NV+V组与NV+18-β-GA组相比，λ值明显降低，表明在正常视觉环境下，注射18-β-GA可以降低水平细胞间缝隙连接的开放水平。
3、形觉剥夺4周，对视网膜Cx36及磷酸化p-Cx36进行免疫荧光染色。
通常Cx36会聚集在一起并形成斑块，所以在分析时以这些斑块为基础，从以下几方面进行分析描述，包括：Cx36与p-Cx36斑块荧光强度的相关性分析、总的Cx36荧光强度、每个斑块的磷酸化水平、Cx36斑块中发生磷酸化的斑块个数的百分比，及平均每个斑块的面积。
在内丛状层,形觉剥夺可以降低Cx36斑块的总的荧光强度总、平均磷酸化水平以及磷酸化斑块个数的百分比，而对每个斑块的平均面积无显著影响；而在外丛状层，Cx36斑块及磷酸化均未发生变化。
4、注射18-β-GA4周，对视网膜进行免疫荧光染色，分析方法同上。
(1)相关性分析在内丛状层，各组的Cx36与p-Cx36荧光强度有明显的线性相关关系。NV组、NV+V组、NV+18-β-GA组的R2分别为0.73、0.75、0.54。在外丛状层，各组也呈明显的线性相关关系,NV组、NV+V组、NV+18-β-GA组的R2分别为0.61、0.84、0.66。(2)Cx36及磷酸化水平，在内丛状层，注射18-β-GA可以同时使Cx36斑块的荧光强度、每个Cx36斑块的磷酸化水平、发生磷酸化斑块个数的百分比下降，而不改变每个其平均面积。在外丛状层，注射18-β-GA可以降低Cx36斑块的荧光强度、发生磷酸化斑块个数的百分以及每个斑块的平均面积，但是对Cx36斑块的磷酸化水平没有明显影响。
结论：
1.模拟形觉剥夺40Lux光照组的水平细胞间电耦联开放水平降低，提示形觉剥夺引起水平细胞电耦联开放水平上升不是由于光照水平下降引起的，而是由于视觉刺激的剥夺引起的。灰色视标组以及镜片离焦组剥夺了视网膜视觉信号或者引起视觉信号质量的下降最后导致近视，但是水平细胞间电耦联水平没有改变，表明形觉剥夺中空间频率因素在近视的发生中起了很小的作用。球旁注射缝隙连接拮抗剂18-β-GA可诱导近视形成，并降低水平细胞之间电耦联，这与形觉剥夺升高水平细胞电耦联水平不一致，提示水平细胞之间的电耦联水平，或者说水平细胞的感受野的改变可能在近视的发生发展中作用较小。
2.形觉剥夺主要降低了内丛状层Cx36的表达及其磷酸化。球旁注射缝隙连接拮抗剂18-β-GA，可降低内丛状层和外丛状层的Cx36含量和磷酸化水平，提示缝隙连接可能通过调控视杆通路介导近视发生。
正常的屈光发育需要正确的视觉信号的引导，它包括视网膜信号转导，脉络膜信号调控及巩膜重塑，其中电耦联是视网膜信号转导的重要组成部分，而构成电耦联的缝隙连接蛋白在视网膜上广泛分布，并参与视网膜的横向和纵向信号转导。本实验室前期试验发现，视网膜缝隙连接参与豚鼠近视的发生发展。所以本课题拟明确视网膜水平细胞间由Cx57构成的缝隙连接，及主要参与视杆通路的Cx36形成的缝隙连接在形觉剥夺性近视中的改变。
方法：
1、形觉剥夺对生物素在水平细胞间扩散范围的影响。
研究视网膜水平细胞缝隙连接开放水平在形觉剥夺性近视中的改变，并进一步探索空间频率及光照在其中的作用，研究空间频率采用了空间频率剥夺模型及离焦诱导近豚鼠模型，以明确形觉剥夺引起的水平细胞间电耦联开放水平的改变是由于光照水平变化还是由于空间频率剥夺引起。
本实验筛选屈光度在+3-+8Diopter(D)，双眼屈光参差＜2D的3周龄三色豚鼠，雌雄不限。随机分为（1）正常视觉环境组(Normalvision，NV)和形觉剥夺组(Formdeprivation，FD，右眼单眼剥夺)；（2）负镜片诱导组（右眼佩戴-4.00D镜片）和平光组（0.00D）；（3）空间频率剥夺组（灰色视标组，gray组；黑白条纹组，Black/Whitegrating组,B/Wgrating组）；（4）正常300Lux视觉环境组（300Lux）和模拟形觉剥夺的40Lux视觉环境组（40Lux）。
2、缝隙连接非选择性拮抗剂18-β-甘草次酸（18-β-Glycyrrhetinicacid，18-β-GA）对生物素在水平细胞间扩散范围的影响。
豚鼠随机分为溶剂对照组(二甲基亚砜，DMSO；NV+V)，18-β-GA组(NV+18-β-GA)。每天球旁注射DMSO或者18-β-GA100μl，两天后，在明适应条件下，利用Cut-loading技术检测生物素在水平细胞间的扩散范围。
3、形觉剥夺对缝隙连接蛋白Cx36的表达及其磷酸化水平的影响。
形觉剥夺4周，利用免疫荧光（Immunofluorescence,IF）方法，检测缝隙连接蛋白Cx36（connexin36）及其磷酸化（p-Cx36）斑块的面积、荧光强度、个数等参数进行定量分析。
4、缝隙连接非选择性拮抗剂18-β-甘草次酸，对连接蛋白Cx36的表达及其磷酸化水平的影响。
动物随机分为溶剂对照组(NV+V)，18-β-GA组(NV+18-β-GA)。每天球旁注射DMSO或者18-β-GA100μl，4周后，利用免疫荧光方法，检测缝隙连接蛋白Cx36及其磷酸化水平。
结果：
1、利用Cut-loading技术处理各组视网膜，观察各组示踪剂扩散情况。根据扩散公式，得到空间常数λ值，λ值越大则表明扩散范围越大，缝隙连接的开放程度越大，本实验研究水平细胞层，遂λ值的大小反映了水平细胞间缝隙连接的开放程度。
（1）形觉剥夺2天，FD组相比NV组，空间常数λ值明显增大，即形觉剥夺促进水平细胞间缝隙连接的开放。（2）镜片诱导2天组，0.00D组与-4.00D相比，λ值无明显变化，即离焦诱导近视对水平细胞间缝隙连接的开放程度无明显影响。（3）空间频率剥夺3周，黑白条纹视标组与灰色视标组相比,空间常数λ值也无明显变化。（4）暗适应40Lux与正常300Lux组相比，空间常数λ值明显降低。
2、正常视觉环境下,注射18-β-GA2天。
明适应环境下，NV组与NV+V组相比，λ值无明显变化，表明注射溶剂对水平细胞间的缝隙连接开放程度无明显影响。NV+V组与NV+18-β-GA组相比，λ值明显降低，表明在正常视觉环境下，注射18-β-GA可以降低水平细胞间缝隙连接的开放水平。
3、形觉剥夺4周，对视网膜Cx36及磷酸化p-Cx36进行免疫荧光染色。
通常Cx36会聚集在一起并形成斑块，所以在分析时以这些斑块为基础，从以下几方面进行分析描述，包括：Cx36与p-Cx36斑块荧光强度的相关性分析、总的Cx36荧光强度、每个斑块的磷酸化水平、Cx36斑块中发生磷酸化的斑块个数的百分比，及平均每个斑块的面积。
在内丛状层,形觉剥夺可以降低Cx36斑块的总的荧光强度总、平均磷酸化水平以及磷酸化斑块个数的百分比，而对每个斑块的平均面积无显著影响；而在外丛状层，Cx36斑块及磷酸化均未发生变化。
4、注射18-β-GA4周，对视网膜进行免疫荧光染色，分析方法同上。
(1)相关性分析在内丛状层，各组的Cx36与p-Cx36荧光强度有明显的线性相关关系。NV组、NV+V组、NV+18-β-GA组的R2分别为0.73、0.75、0.54。在外丛状层，各组也呈明显的线性相关关系,NV组、NV+V组、NV+18-β-GA组的R2分别为0.61、0.84、0.66。(2)Cx36及磷酸化水平，在内丛状层，注射18-β-GA可以同时使Cx36斑块的荧光强度、每个Cx36斑块的磷酸化水平、发生磷酸化斑块个数的百分比下降，而不改变每个其平均面积。在外丛状层，注射18-β-GA可以降低Cx36斑块的荧光强度、发生磷酸化斑块个数的百分以及每个斑块的平均面积，但是对Cx36斑块的磷酸化水平没有明显影响。
结论：
1.模拟形觉剥夺40Lux光照组的水平细胞间电耦联开放水平降低，提示形觉剥夺引起水平细胞电耦联开放水平上升不是由于光照水平下降引起的，而是由于视觉刺激的剥夺引起的。灰色视标组以及镜片离焦组剥夺了视网膜视觉信号或者引起视觉信号质量的下降最后导致近视，但是水平细胞间电耦联水平没有改变，表明形觉剥夺中空间频率因素在近视的发生中起了很小的作用。球旁注射缝隙连接拮抗剂18-β-GA可诱导近视形成，并降低水平细胞之间电耦联，这与形觉剥夺升高水平细胞电耦联水平不一致，提示水平细胞之间的电耦联水平，或者说水平细胞的感受野的改变可能在近视的发生发展中作用较小。
2.形觉剥夺主要降低了内丛状层Cx36的表达及其磷酸化。球旁注射缝隙连接拮抗剂18-β-GA，可降低内丛状层和外丛状层的Cx36含量和磷酸化水平，提示缝隙连接可能通过调控视杆通路介导近视发生。