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目的:壬基酚是一种持久性有机污染物,可以通过食物链的蓄积作用进入人体,最终对机体各个系统造成严重影响。近年来,有关壬基酚神经毒性的研究报道越来越多。现已有明确证据证明其对神经递质及其受体、神经生长因子以及脂质过氧化等方面的影响,也有证据表明壬基酚与神经元的凋亡等程序性死亡有密切联系。铁死亡作为一种氧化性、铁依赖性的细胞死亡形式,在2012年被Dixon等人首次发现,是程序性细胞死亡（Programmed cell death,PCD）之一。自噬是一个细胞成分如大分子蛋白或整个细胞器被隔离到溶酶体中进行降解的过程,在一定条件下,自噬可以通过降解铁蛋白来增加游离铁的浓度从而引起脂质过氧化。本研究通过建立大鼠壬基酚暴露模型,探讨壬基酚对神经元铁死亡产生的影响及可能机制;在此基础上,建立人源神经细胞系（SH-SY5Y）的壬基酚暴露模型,通过自噬抑制剂氯喹（Chloroquine,CQ）探讨自噬在壬基酚所致神经元铁死亡发生中的作用及机制。研究方法:1.壬基酚暴露动物模型的建立:对SD雄性大鼠每天进行不同剂量的壬基酚灌胃染毒,染毒浓度分别为5mg/kgbw、10mg/kgbw、50mg/kgbw,对照组直接使用不添加壬基酚的玉米油进行灌胃。染毒第28天处死,取海马待测。2.壬基酚神经细胞系暴露模型的建立:将人神经母细胞瘤细胞系（Human neuroblastoma cells,SH-SY5Y）进行多个浓度的壬基酚染毒,染毒浓度分别为5μM、10μM、15μM,对照组为同期处理的无染毒细胞,染毒时间均为24小时。选择10μM壬基酚染毒组,分别添加25μM CQ（自噬抑制剂）、100μM去铁胺（Deferoxamine,DFO,铁死亡抑制剂）。上述处理结束后收取细胞样品待测。3.大鼠神经行为学检测:通过大鼠水迷宫实验,对大鼠训练期目标象限潜伏期,测试期进入平台象限次数,平台象限滞留时间以及平台潜伏期进行检测。4.大鼠海马铁死亡相关指标的检测:收取大鼠海马样品,通过Western blot检测铁死亡相关蛋白GPX4含量,用铁离子试剂盒检测铁离子含量,用免疫荧光观察海马神经元的脂质过氧化产物4羟基壬烯醛（4 Hydroxynonenal,4-HNE）含量。5.大鼠海马自噬相关指标的检测:通过Western blot检测自噬相关蛋白LC3、P62、LAMP2的含量,用免疫荧光观察海马神经元的LC3含量。6.大鼠海马铁自噬通路相关指标的检测:通过Western blot检测铁自噬相关蛋白铁蛋白重多肽（Ferritin heavy polypeptide,FTH1）、核受体辅激活因子（Nuclear receptor coactivator 4,NCOA4）的含量,用免疫荧光观察海马神经元的FTH1含量。7.SH-SY5Y细胞活力的检测:收取SH-SY5Y神经细胞样品,通过CCK-8检测细胞活力,选取5μM、10μM、15μM剂量组;通过Western blot检测铁死亡相关指标GPX4和FTH1,选择铁死亡发生最显著的10μM剂量组进行后续的抑制剂研究。8.SH-SY5Y神经细胞铁死亡相关指标的检测:选择10μM剂量组,通过加入DFO,使用Western blot检测GPX4含量,使用免疫荧光检测海马神经元的4-HNE含量,从侧面验证铁死亡的发生。9.SH-SY5Y神经细胞铁自噬通路发生的检测:选择10μM剂量组,加入自噬抑制剂CQ,使用Western blot检测LC3和P62含量。证实自噬得到抑制后,使用Western检测GPX4、NCOA4和FTH1含量,使用免疫荧光检测海马神经元的4-HNE和FTH1含量。结果:1.壬基酚暴露影响大鼠神经行为学表现:大鼠的莫里斯水迷宫实验结果显示,与对照组相比,10mg/kg剂量组大鼠进入平台次数减少,5mg/kg和10mg/kg剂量组平台所在象限逗留时间减少,50mg/kg剂量组到达平台的潜伏期减少（P＜0.05）。2.壬基酚暴露导致大鼠海马铁死亡的发生:Western blot结果显示,10mg/kg剂量组和50mg/kg剂量组海马GPX4蛋白含量较对照组显著降低（P＜0.05）。铁离子试剂盒检测结果显示,50mg/kg剂量组海马铁离子含量较对照组显著升高（P＜0.05）。免疫荧光结果显示,壬基酚暴露组海马神经元4-HNE含量较对照组升高。3.壬基酚暴露导致大鼠海马自噬的发生:Western blot结果显示,与对照组海马相比,10mg/kg剂量组和50mg/kg剂量组LC3Ⅱ/Ⅰ含量显著上升,P62蛋白含量显著下降（P＜0.05）。50mg/kg剂量组LAMP2蛋白含量显著上升（P＜0.05）。免疫荧光结果显示,壬基酚暴露组海马神经元的LC3蛋白含量较对照组升高。4.壬基酚暴露导致大鼠海马铁自噬通路的激活:Western blot结果显示,与对照组海马相比,50mg/kg剂量组FTH1和NCOA4蛋白含量显著下降（P＜0.05）。5.壬基酚暴露导致SH-SY5Y神经细胞铁死亡的发生:Western blot结果显示,与对照组SH-SY5Y神经细胞相比,10μM剂量组GPX4和FTH1蛋白含量显著下降（P＜0.05）;与10μM剂量组SH-SY5Y神经细胞相比,DFO抑制剂+壬基酚染毒组GPX4和FTH1蛋白含量显著回升（P＜0.05）。6.自噬抑制剂CQ可阻断壬基酚暴露所致SH-SY5Y神经细胞的铁死亡:Western blot结果显示,与壬基酚染毒组SH-SY5Y神经细胞相比,CQ抑制剂+壬基酚染毒组GPX4、FTH1和NCOA4蛋白含量显著升高（P＜0.05）。免疫荧光结果显示,与壬基酚染毒组相比,CQ抑制剂+壬基酚染毒组海马神经元的4-HNE含量下降,FTH1蛋白含量回升。结论:1.壬基酚暴露导致大鼠海马神经元发生铁死亡。2.壬基酚暴露导致大鼠海马神经元发生自噬。3.自噬参与了壬基酚暴露所致的神经元铁死亡。