鸭蛋蛋清肽-亚铁螯合物的制备及抗缺铁性贫血研究

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为了实现咸鸭蛋清优质蛋白的综合利用,开发具有高效补铁作用的肽类产品,本文以咸鸭蛋蛋清为原料,首先以亚铁离子的螯合率为主要评价指标,筛选出合适的蛋白酶,并制备高活性促铁吸收鸭蛋蛋清肽;其次以Fe SO4为铁源,制备鸭蛋蛋清肽-亚铁螯合物,并对其稳定性进行研究;再通过多种手段对肽与肽-亚铁螯合物进行结构表征,利用超滤分级、氨基酸分析和液质联用,结合蛋白数据库比对,鉴定了部分鸭蛋蛋清肽中的一级结构;最后建立缺铁性贫血大鼠模型,评价了鸭蛋蛋清肽-亚铁螯合物的促铁吸收生物学功效,比较了鸭蛋蛋清肽-亚铁螯合物和Fe SO4的补铁效果。本文的主要研究结果如下:1.促铁吸收鸭蛋蛋清肽的制备从实验中筛选得到最佳的蛋白酶—中性蛋白酶,用其酶解制备鸭蛋蛋清蛋白。最佳酶解参数为:鸭蛋清浓度4%、加酶量15000 U/g、温度为50°C、p H7、酶解时间2.5 h。此时,水解度为13.11%,亚铁的螯合率为58.75%。2.鸭蛋蛋清肽-亚铁螯合物的制备与稳定性研究鸭蛋蛋清肽-亚铁螯合物最佳制备条件为:抗坏血酸与亚铁盐的质量比0.2:1,鸭蛋蛋清肽溶液的浓度为4%,肽与亚铁盐的质量比为3:1,p H为5.5,反应时间为40 min,反应温度为40°C,乙醇的添加量为反应液体积的7倍,在此条件下亚铁的螯合率为65.15%,螯合物得率为44.46%。鸭蛋蛋清肽-亚铁螯合物经过胃蛋白酶、胰蛋白酶消化后,仍保持有65.75%的亚铁持有率,表明其对消化酶有一定的耐受性;其在强酸性和碱性条件下极易解离,在p H=7时,亚铁的持有率为80.12%;在高温下不稳定;基本不受共存食物蔗糖、Na Cl的影响。3.鸭蛋蛋清肽的表征与结构鉴定红外光谱结果显示Fe2+与肽的氨基端与羧基端相结合,荧光光谱表明Fe2+与肽螯合以后导致荧光强度降低,激光动态光散射仪测定结果表明形成螯合物以后半径增大(P<0.05)、电位的绝对值降低(P<0.05),圆二色谱测定结果说明螯合前后二级结构发生了改变,且α螺旋的含量显著降低(P<0.05)、β折叠的含量显著升高(P<0.05),扫描电镜显示形成螯合物以后,表面变的粗糙,为紧密状的颗粒聚集体,能谱仪显示形成的螯合物中Fe元素含量显著提高(P<0.05)、Fe元素的对应峰增强,差示扫描量热仪测定结果表明螯合物的热稳定性高于肽。通过超滤膜对鸭蛋蛋清肽进行分级,分子量低于1 k Da的级份对亚铁离子的螯合能力最强。对其氨基酸含量进行分析,结果表明其含有的酸性氨基酸及Leu、Ser、Thr、Lys、Met相对较高。通过液质联用技术,并与蛋白数据库比对,从鸭蛋蛋清肽中解析出了33个较高活性促铁吸收肽段,主要为聚合度3-5的短肽。4.鸭蛋蛋清肽-亚铁螯合物的抗贫血作用缺铁性贫血大鼠模型表明鸭蛋蛋清肽-亚铁螯合物是一种良好的补铁剂,一方面,鸭蛋蛋清肽-亚铁螯合物可以有效恢复缺铁性贫血大鼠体重至正常组水平(P>0.05),显著减轻由缺铁性贫血引起的脏器指数的增大(P<0.05),提高Hb、RBC、HCT、MCH、MCV、SI、SF指标至正常组水平(P>0.05)。另一方面,鸭蛋蛋清肽-亚铁螯合物可以降低二价金属离子转换器、铁转运蛋白的基因表达,提高铁调素基因表达至正常组水平(P>0.05)。同时,鸭蛋蛋清肽-亚铁螯合物比同剂量的Fe SO4具有更好的补铁效果(P<0.05)。
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