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目的 本实验通过构建RAW264.7源性泡沫细胞模型,探讨CTRP9对RAW264.7巨噬细胞源性泡沫细胞胆固醇逆转运相关蛋白ABCA1、ABCG1、LXRa的表达及胆固醇含量影响,进一步阐述其可能的机制。 方法: 1.体外培养RAW264.7细胞,加入终浓度为50mg/L氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)干预,再孵育24h,将其诱导成泡沫细胞。 2.实验分组 (1)测定不同时间CTRP9对RAW264.7源性泡沫细胞各指标及胆固醇含量影响:①对照组;②1小时实验组;③3小时实验组;④6小时实验组。用磷酸盐缓冲液将CTRP9稀释至3ug/ml,分别加入上述实验组进行培养。实时荧光定量Real-Time PCR法测定各组细胞ABCA1、ABCG1、LXRa mRNA的相对表达量,Western-blot测定各组细胞ABCA1、ABCG1、LXRa 的蛋白含量,高效液相色谱测定细胞内胆固醇含量。观察CTRP9对RAW264.7源性泡沫细胞中ABCA1、ABCG1、LXRa的影响。筛选出CTRP9对RAW264.7源性泡沫细胞的各指标及胆固醇含量影响的最佳的时间点。 (2)测定不同浓度CTRP9对RAW264.7源性泡沫细胞的各指标及胆固醇含量影响:①空白对照组;②0.3ug/ml CTRP9组;③1ug/ml CTRP9组;④3ug/ml CTRP9组。①用不含CTRP9的培养液进行培养,培养3小时;②至④用含相应浓度 CTRP9的培养液进行培养,培养3小时。实时荧光定量Real-Time PCR法测定各组细胞ABCA1、ABCG1、LXRa mRNA的相对表达量,Western-blot测定各组细胞ABCA1、ABCG1、LXRa 的蛋白含量,高效液相色谱测定细胞内胆固醇含量。观察CTRP9对RAW264.7源性泡沫细胞中ABCA1、ABCG1、LXRa的作用。筛选出CTRP9对RAW264.7源性泡沫细胞的各指标及胆固醇含量影响的最佳的浓度。 结果: ⑴利用ox-LDL成功把RAW264.7细胞诱导成为泡沫细胞; ⑵RT PCR和Western-blot结果示:在相同浓度下,正常RAW264.7源性泡沫细胞内各指标mRNA、蛋白表达水平很低,在CTRP9干预1小时后各指标的水平开始增高,随着时间的延长,各组指标含量显著升高,且在3小时达到高峰,6小时含量降低,但与对照组比含量仍高(P<0.05);高效液相色谱结果示:正常RAW264.7源性泡沫细胞内胆固醇含量很高,在CTRP9干预1小时后胆固醇含量开始降低,随着时间的延长,胆固醇含量显著降低,且在3小时达到最低,6小时含量最高,但与对照组比含量仍低(P<0.05)。综合以上结果表明3小时实验组对RAW264.7源性泡沫细胞的各指标及胆固醇含量作用最显著。 ⑶RT PCR和Western-blot结果示:在相同时间下,随着CTRP9浓度递增加,细胞各指标的mRNA的及蛋白表达水平逐渐增加,细胞内胆固醇水平逐渐降低,在CTRP9浓度达到3ug/ml时细胞各指标的 mRNA及蛋白表达量最高,细胞内胆固醇含量最低,综合以上结果表明3ug/ml CTRP9组对RAW264.7源性泡沫细胞的各指标及胆固醇含量作用最显著(P<0.05); 结论: 1.CTRP9通过mRNA和蛋白水平上增加RAW264.7源性泡沫细胞ABCA1、ABCG1、LXRa 表达,同时使胆固醇流出率增加,使细胞内胆固醇含量下降。 2.CTRP9通过mRNA和蛋白水平上增加RAW264.7源性泡沫细胞ABCA1、ABCG1、LXRa 表达,同时使胆固醇流出率增加,使细胞内胆固醇含量下降,并具有时间和浓度依赖性。