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背景:基因治疗和组织工程是目前研究解决骨损伤和骨疾病的热门领域和具有希望前景的手段。间充质干细胞因其成骨特性和潜能成为为骨再生和骨组织工程的种子细胞和基本要素。BMP-2的基因转染能有效的治愈骨折骨缺损。多种细胞信号通路参与骨细胞的分化、增殖和代谢维持并存在相互协调或调节的影响,其中BMP信号通路和Wnt信号通路在骨的发生和发展中均起着关键性作用,由于两者信号通路的复杂的分子基础和信号网络,它们在骨形成过程中的作用更为复杂和多样,具体详细的“串话”机制仍不明了。了解其中的关键机制将有助于骨相关疾病的药物靶点治疗和基因治疗。目的:(1)本研究通过使用携带rhBMP-2基因的质粒转染小鼠间充质干细胞(C3H101/2)研究pCDNA3.1-rhBMP-2基因重组质粒的成骨效应和C3H101/2的成骨活性;(2)BMP-2能否上调和激活Wnt/β-catenin通路中已经明确的关键因子;(3)探讨BMP-2/Smad信号通路对在Wnt/β-catenin通路的交互可能作用机制和方式,试寻其中可能关键调节因子,为今后骨相关疾病的基因治疗和药物靶点治疗提供理论和实验基础。一、rhBMP-2基因转染小鼠间充质干细胞C3H10T1/2的成骨活性和增殖能力研究方法:在本实验第一部分主要通过以下几种实验手段和技术完成研究。(1)通过已构建的研究pCDNA3.1-rhBMP-2基因重组质粒转染C3H10T1/2细胞,利用质粒本身携带的G418抗药性对转染的细胞进行筛查,明确转染是否成功。(2)观察pCDNA3.1质粒进行基因转染后对细胞上清液中的BMP-2含量的变化,进行ELISA检测,从中观察BMP-2的释放机制和水平。(3)使用CCK-8试剂盒对转染pCDNA3.1-rhBMP-2基因重组质粒的细胞进行增值活性的检测。(4)随后对C3H10T1/2细胞成骨分化进行检测,检测其ALP活性并进行ALP染色和茜素红钙结节染色了解其中成骨活性,了解其成骨强度变化。结果:(1)BMP-2ELISA结果显示:转染组BMP-2浓度升高并维持在较高水平并且均明显高于空白组和空载组(p<0.05)。(2)转染组的增殖趋势最明显,细胞数量随时间增加而增加,其中细胞在第4d至第8d增殖最快,第8d后逐渐进入平台期。(3)ALP检测结果显示,转染组在第7d至第21d增加最明显,第21d达到高峰(P<0.05)。(4)转染组两种ALP染色和茜素红钙结节染色均比空载组和空白组有较深的阳性结果。结论:(1)pcDNA3.1/rhBMP-2重组质粒是一种廉价、安全有效的转染方式,能在一定时间内平稳和持续的高表达外源性BMP-2。(2)C3H10T1/2细胞是pcDNA3.1/rhBMP-2重组质粒的良好宿主,能成骨表达外源性BMP-2。(3)BMP-2是有效骨诱导剂,能促进细胞的增殖和诱导间充质干细胞成骨分化,促进钙的沉积。二、BMP与Wnt信号通路串话作用在间充质干细胞成骨作用的研究方法:在第二部分中我们采用Western-blot和RT-PCR方法检测BMP-2诱导C3H10 1T2细胞分化成骨细胞过程中Wnt/β-catenin通路中关键细胞因子β-catenin、pβ-catenin、RUNX2、LEF1的表达情况,探讨这些关键因子在BMP-2诱导成骨分化过程中的作用。同时检测BMP-2/Smad信号通路中重要的调解因子Smurf-2水平和β-catenin关键的胞浆内结构稳定因子Axin、GSK3 β,探讨Smurf-2对β-catenin的可能影响机制。结果:在BMP-2诱导成骨细胞分化的过程中,转染组增加β-cateninmRNA的表达和促进β-catenin蛋白磷酸化水平(t=7.609,p=0.002)。转染组上调Wnt/β-catenin通路中的重要转录因子LEF1的mRNA表达和蛋白合成(t=4.256,p=0.013)。在BMP-2诱导的成骨细胞分化中,Smurf-2mRNA表达和蛋白表达相对于对照组少(t=7.609,p=0.013)。转染BMP-2基因后能明显上调提高BMP-2 mRNA,而对细胞内β-catenin降解复合体GSK3β-APC-Axin2的表达起下调作用。结论:在探讨BMP信号通路和Wnt/β-catenin通路在成骨细胞分化过程中的串话机制中,我们发现成骨分化过程中BMP信号通路与Wnt/β-catenin通路存在串话机制。(1)BMP-2能上调Wnt/β-catenin通路中关键细胞因子β-catenin、p β-catenin、RUNX2、LEF1的表达,参与Wnt/β-catenin通路的激活;(2)BMP信号通路能通过影响Smurf-2、Axin、GSK3β共同来调节细胞内β-catenin的稳定和积蓄;(3)BMP-2增加β-catenin的磷酸化水平,促进活化后的β-catenin向核内转导和向下游信号网络的传递。