宫颈癌是女性第四大常见癌症,也是癌症导致女性死亡的第四大病因。根据国际癌症研究机构(International Agency for Research on Cancer)发布的最新全球数据,2018年全球共有569847例宫颈癌新发病例,311365人死于宫颈癌。虽然HPV疫苗接种和早期宫颈癌筛查已成为预防该病的有效策略,但在中低收入国家(LMICs)中依然存在着该病较高的发病率和死亡率。尽管中国宫颈癌患者的生存率有了明显的提高,但我们相比较于其他发达国家仍存在着一定的差距。高危型人乳头瘤病毒HPV的持续感染,被认为是宫颈癌发生发展的主要原因。目前,临床上应用的宫颈癌筛查的主要方法是宫颈液基细胞学检查联合HPV病毒检测,但细胞学检测受到人为影响较大,漏诊几率较高,HPV检测特异性较低,存在过度治疗的局限性。近年来,随着对表观遗传学的研究,尤其是DNA甲基化检测技术的成熟,作为癌症发生的早期阶段,DNA甲基化检测逐步成为宫颈癌前病变检测的新兴诊断方法。大量甲基化基因如SOX1、PAX1、JAM3、EPB41L3、CADM1、MAL等也被认为是宫颈癌筛查的生物标志物。为了进一步提高宫颈癌的筛查效能,探索和开发更灵敏、特异的DNA甲基化检测方法具有重要意义。根据 NCCN(National Comprehensive Cancer Network)指南提示,标准的进展期宫颈癌治疗方式是放疗和以铂类为主的化疗相联合。虽然放疗可以有效控制肿瘤局部复发,提高生存率,但放疗对骨髓抑制、消化道反应等毒副作用以及对患者生活质量和精神经济上的负担都不容忽视,肿瘤细胞对放疗的抵抗仍然是一个主要的治疗障碍。因此,探究宫颈癌发生发展和放疗抵抗的分子机制,对宫颈癌的精准治疗具有重大意义。Septins是一个GTP结合蛋白家族,参与多种生物学过程,如细胞骨架形成、细胞分裂和肿瘤形成等。Septin9(SEPT9)是Septin家族中第一个被发现的成员,其启动子超甲基化已被证实是结直肠癌、胃癌、肺癌等癌症的一个强有力的生物标志物。SEPT9在乳腺癌、卵巢癌、头颈鳞癌和前列腺癌中均表现为促进癌症发生发展,促进肿瘤细胞的增殖和转移等。然而,SEPT9甲基化在宫颈癌筛查中的效能仍未见报道,关于SEPT9在宫颈癌中的作用及相关调控机制的研究尚不清楚。本课题拟研究SEPT9 DNA甲基化检测在宫颈癌早期诊断中的作用,探究SEPT9在宫颈癌发生发展及放疗耐受中的作用及相关分子机制,具体研究内容包括以下三个部分:第一部分SEPT9DNA的甲基化在宫颈癌早期诊断中的作用研究目的:1.DNA甲基化检测在宫颈癌早期诊断中的作用备受关注,在多种恶性肿瘤中存在SEPT9基因DNA甲基化的改变,检测SEPT9DNA甲基化水平与宫颈癌病变发生之间的关系。2.检测SEPT9在宫颈癌患者中的表达情况以及与临床病理因素、预后的关系,分析其DNA甲基化与基因表达之间的关系。研究方法:1.通过全基因组甲基化芯片筛选出甲基化差异表达基因,设计甲基化特异性引物,利用实时甲基化特异性PCR技术(QMSP)检测正常宫颈组织、CIN1、CIN2、CIN3及宫颈癌组织中SEPT9DNA甲基化水平。应用logistic回顾性分析SEPT9甲基化检测对宫颈癌早期诊断的效能。2.使用实时定量聚合酶链锁反应(qRT-PCR)检测SEPT9在宫颈癌和正常宫颈组织中mRNA水平的表达情况,比较DNA甲基化水平与mRNA表达水平之间的关系;借助Western Blot和免疫组化技术检测SEPT9在蛋白水平的表达情况。采用卡方检验分析SEPT9的表达与宫颈癌患者临床病理相关因素间的关系,采用Kaplan-Meier法分析其基因表达水平与患者临床预后之间的关系。研究结果:1.SEPT9 DNA在宫颈癌组织中呈现高甲基化水平甲基化芯片筛选出SEPT9在宫颈癌组织中异常甲基化,QMSP检测SEPT9 DNA在宫颈癌组织中呈现高甲基化。检测正常宫颈组织、CIN1、CIN2、CIN3和宫颈癌组织中SEPT9启动子区DNA的甲基化水平,结果提示:SEPT9甲基化水平在正常组织和CIN1组织中无明显差异;在CIN2和CIN3两组间无明显差异;在CIN1和CIN3两组间存在显著差异;在正常和癌组织中存在显著差异(P<0.001)。2.SEPT9甲基化检测对宫颈癌诊断具有较高的敏感性和特异性。应用logistic回顾性分析SEPT9甲基化检测对宫颈癌的诊断效能:(1)通过分析正常组织和癌组织两组间SEPT9的甲基化水平,AUC面积为0.854,敏感性为73.1%,特异性为78.7%(P<0.001);(2)将正常组织和CINI组织作为正常组,CIN2、CIN3和癌组织作为病变组,两组比较SEPT9甲基化水平,结果显示AUC面积为0.797,敏感性为89.5%,特异性为63.3%(P<0.001)。3.SEPT9基因在宫颈癌组织中呈高表达qRT-PCR检测结果显示:SEPT9在宫颈癌组织中的表达明显高于癌旁正常组织。Pearson相关检验法证实SEPT9甲基化水平与mRNA表达水平呈正相关关系(r=0.6526,P<0.001)。SEPT9在蛋白水平中也表现为宫颈癌组织中高表达(占比78.8%),正常组织中低表达(占比94.1%)。4.SEPT9基因的表达与宫颈癌淋巴结转移相关,但与患者预后无明显关系SEPT9的表达与宫颈癌患者的年龄、FIGO分期、肿瘤大小、分化程度和淋巴脉管间隙浸润均无明显关系,但与淋巴结转移情况相关(P=0.022)。在22例淋巴结阳性患者中有21例表现为SEPT9高表达,占比95.5%;在53例淋巴结阴性患者中38例表现为SEPT9高表达,占比71.7%。Kaplan-Meier生存分析结果显示,SEPT9高表达与低表达患者之间的生存预后差别无统计学意义(P=0.690)。研究结论:1.SEPT9在CIN3及宫颈癌组织中呈现异常高甲基化。2.SEPT9DNA甲基化检测对宫颈癌早期诊断具有较高的敏感性和特异性。3.SEPT9在宫颈癌中呈现高表达水平,与其淋巴结转移相关。第二部分SEPT9在宫颈癌中的生物学行为及相关机制研究研究目的:SEPT9广泛存在于人体各个组织器官中,并在多种肿瘤中发现SEPT9的表达和功能各不相同。基于第一部分我们发现SEPT9在宫颈癌中高表达,DNA甲基化也呈现出高甲基化水平,与高甲基化抑制基因表达的认知相反,在此部分深入研究SEPT9在宫颈癌中究竟扮演抑癌基因还是促癌基因的角色,探索其在宫颈癌中发挥作用的调节机制。研究方法:1.构建稳定转染干扰及过表达SEPT9基因的宫颈癌细胞系,利用CCK-8实验检测SEPT9对宫颈癌细胞系增殖能力的影响,利用Transwell实验检测SEPT9对宫颈癌细胞系侵袭和迁移能力的影响,利用流式细胞术检测SEPT9对宫颈癌细胞系细胞周期分布的影响,利用Western Blot方法检测SEPT9对宫颈癌细胞系上皮间质转化及增殖相关分子的影响,裸鼠成瘤实验证实SEPT9促进肿瘤增殖。2.应用液相色谱—质谱分析SEPT9结合蛋白,利用免疫共沉淀技术验证HMGB1与SEPT9之间的关系。免疫组化分析HMGB1在宫颈癌中的表达,功能性实验验证HMGB1对宫颈癌细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响。3.免疫共沉淀技术验证HMGB1与RB之间的关联。通过Rescue实验验证SEPT9对宫颈癌的作用是通过HMGB1-RB通路实现对下游周期相关分子的表达调控。研究结果:1.SEPT9促进宫颈癌细胞系的增殖、侵袭、迁移能力CCK-8实验结果显示SEPT9能够增强宫颈癌细胞增殖的能力。Transwell实验结果表明:SEPT9促进宫颈癌细胞侵袭和迁移能力。流式细胞术分析表明SEPT9下调可使宫颈癌细胞发生G0/G1期阻滞,而上调SEPT9则促进细胞从G0/G1期向S期转化,促进细胞周期进程。Western Blot 结果表示:SEPT9 敲低后,Snail、CyclinA2、p-Akt、p-mTOR表达均有不同程度的下降,E-cadherin、CyclinD1的表达则明显升高;而SEPT9过表达后,呈相反趋势。2.体内实验证实SEPT9促进肿瘤增殖裸鼠成瘤实验表明SEPT9过表达可促进皮下宫颈癌肿瘤的生长(P<0.01)。3.SEPT9负调控HMGB1的表达通过液相色谱—质谱结合数据库分析查询SEPT9结合蛋白,列举了评分排名前20的结合蛋白。经Co-IP实验验证SEPT9与HMGB1之间存在蛋白结合关系。免疫组化染色显示:SEPT9的表达与HMGB1呈紧密的负相关关系(r=0.836,P<0.001)。4.HMGB1抑制宫预癌细胞系增殖、侵袭、迁移的能力CCK-8实验分析发现HMGB1下调后细胞增殖能力有所增强,HMGB1上调后细胞增殖能力明显减弱。Transwell实验显示HMGB1下调后细胞的侵袭和迁移能力有所增强,HMGB1上调后细胞的侵袭和迁移能力均明显下降。5.SEPT9能够调控HMGB1-RB通路及下游周期相关分子的表达水平利用Co-IP实验验证HMGB1与RB之间存在蛋白结合关系。Rescue实验证明当SEPT9过表达细胞中的HMGB1被敲低后,RB表达降低,E2F1表达降低,P16表达升高,CyclinDl表达降低,CycilinA2表达升高,反之亦然。研究结论:SEPT9通过调控HMGB1-RB通路,影响宫颈癌细胞系增殖、转移的能力,影响宫颈癌细胞系细胞周期的分布,发挥促癌作用。第三部分SEPT9对宫颈癌放疗抵抗的影响及作用机制研究研究目的:1.放疗可以有效地控制宫颈癌肿瘤局部复发和提高生存率,但放疗抵抗是治疗的主要障碍,利用体内体外实验验证SEPT9对宫颈癌放疗抵抗的影响。2.探究SEPT9与肿瘤相关巨噬细胞TAMs在宫颈癌放疗中的关系。3.探究miR-375与SEPT9之间的关系及miR-375对TAMs极化的影响。研究方法:1.利用CCK-8实验检测在不同放射剂量下SEPT9的干扰或过表达对宫颈癌细胞存活率的影响。细胞免疫荧光实验和Western Blot检测γ-H2AX的含量。建立裸鼠宫颈癌皮下移植瘤模型,进一步验证SEPT9在动物体内对肿瘤放疗的影响。2.免疫组化染色检测CD206在宫颈癌组织和正常宫颈上皮组织中的表达情况。将过表达SEPT9的宫颈癌细胞进行一定剂量X射线照射,其条件培养基刺激巨噬细胞极化,免疫荧光法和Western Blot检测相关表型标记物的水平,探究放疗后SEPT9对巨噬细胞极化的影响。3.分析宫颈癌TCGA数据库中SEPT9的表达和miRNA之间的差异表达,寻找SEPT9与miR-375表达之间的关系。4.对X射线照射后的SEPT9过表达宫颈癌细胞系转染miR-375的模拟物,收集条件培养基处理巨噬细胞,通过荧光显微镜观察巨噬细胞中miR-375的含量;将巨噬细胞转染miR-375模拟物,诱导后Western Blot检测相关表型标记物水平,探究miR-375对巨噬细胞极化的影响。研究结果:1.SEPT9增强宫颈癌的放疗抵抗性CCK-8结果显示:在不同放射剂量下,SEPT9过表达后宫颈癌细胞的存活率升高。细胞免疫荧光和Western Blot检测实验结果均显示:在进行相同剂量的X射线照射后,SEPT9过表达的宫颈癌细胞中γ-H2AX含量较少。裸鼠成瘤后对其进行相同剂量的X射线放射治疗,结果显示:放疗后裸鼠肿瘤体积均缩小,SEPT9过表达组肿瘤体积缩小比例明显小于对照组。2.SEPT9通过调节巨噬细胞极化影响宫颈癌细胞的放疗抵抗性免疫组化染色结果显示:宫颈癌组织中CD206表达量较正常组织高。通过细胞免疫荧光法、PCR检测和Western Blot检测,结果显示:SEPT9过表达后的宫颈癌细胞系在经过一定剂量的放疗后细胞中CD206、Argl的含量均明显增加,说明SEPT9可刺激巨噬细胞向M2表型极化。3.SEPT9 mRNA的表达水平与miR-375之间的关系分析宫颈癌TCGA数据库中SEPT9与microRNA含量之间的差异表达,确定miR-375为SEPT9下游靶分子。细胞实验结果显示:SEPT9敲低后miR-375的表达水平相应降低,SEPT9过表达后miR-375的表达水平随之升高。4.SEPT9通过介导miR-375影响巨噬细胞极化与对照组相比,经过同等剂量放射后SEPT9过表达组的条件培养基中miR-375含量更多。Western Blot检测发现miR-375模拟物组中M2表型标记物CD206和Arg1水平显著增加,说明miR-375可以促进巨噬细胞向M2表型极化。研究结论:SEPT9通过介导miR-375调节巨噬细胞向M2型极化进而影响宫颈癌细胞的放疗抵抗性。