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组织滴虫病又称“盲肠肝炎”或“黑头病”,是由兼性厌氧的寄生原虫火鸡组织滴虫（Histomonas meleagridis,H.meleagridis）寄生于鸡形目禽类引起的一种原虫病,主要特征为硫磺样粪便、盲肠肿大和肝脏坏死,死亡率达20%-30%,严重危害养禽业的发展。近些年,人们对药物残留肉蛋、环境污染等公共安全卫生方面的关注,许多化学药物被禁用,加上缺乏商品化疫苗,导致该病的防控面临巨大挑战。本实验室前期差异蛋白组学分析发现,α-actinin1蛋白在强毒株中高表达,弱毒株中低表达,且在其它原虫中已有研究报道α-actinin为细胞骨架、细胞运动相关的毒力蛋白,因此,为了进一步研究其在火鸡组织滴虫生长发育、运动等生物学功能中的作用,本论文克隆表达了α-actinin 1基因,对其编码蛋白进行了抗原性分析,并制备多抗和单抗分析了 α-actinin1蛋白在虫体中的分布,最后通过动物保护试验评价了其对鸡群感染火鸡组织滴虫的免疫保护效果,旨在为火鸡组织滴虫亚单位疫苗的研制奠定基础。1.火鸡组织滴虫α-actinin1基因的克隆表达根据GenBank中火鸡组织滴虫α-actinin1基因序列（FM200068）设计引物,提取虫体总RNA,RT-PCR法扩增Hmα-actinin 1基因,测序分析后,将目的基因经BamHⅠ和NotⅠ双酶切后,T4 DNA连接至原核表达载体pET28a（+）,构建重组质粒pET28a（+）-Hmα-actinin 1,并转化至BL21（DE3）,IPTG诱导表达,HIS标签单抗鉴定表达产物。结果显示,火鸡组织滴虫Hmα-actinin 1基因（MW197428）全长为1839bp,共编码612个氨基酸,与GenBank中登录的火鸡组织滴虫α-actinins各亚型间同源性较高,范围在61.8%～99.8%,与阴道毛滴虫亲缘关系最近,同源性在52.5%～53.9%。将重组质粒pET28a（+）-Hmα-actinin 1转化至BL21（DE3）成功诱导表达,表达产物能被HIS标签单抗特异性识别,主要以可溶形式在大肠杆菌中表达,大小与预期相符,约为73kDa。2.火鸡组织滴虫rHmα-actinin 1蛋白的抗原性和天然蛋白定位分析纯化的重组蛋白rHmα-actinin 1免疫小鼠,制备鼠抗rHmα-actinin 1多抗,对rHmα-actinin1重组蛋白的抗原性进行分析,同时应用鸡源、火鸡源抗火鸡组织滴虫阳性血清对rHmα-actinin 1进行了抗原性分析。以rHmα-actinin 1为免疫原,经细胞融合、阳性杂交瘤细胞筛选、亚克隆等步骤制备抗rHmα-actinin 1蛋白单克隆抗体,并分别以鼠抗重组蛋白多抗及杂交瘤细胞上清通过IFA法检测天然蛋白Hmα-actinin1在虫体中的分布。结果显示,鸡源、火鸡源抗火鸡组织滴虫阳性血清及鼠抗重组蛋白多抗均能特异性识别rHma-actinin 1。经三次亚克隆共得到三株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其中4C2、2F1单克隆抗体为IgG1亚类,4D10单克隆抗体为IgG2b亚型,能特异性识别虫体中α-actinin 1天然蛋白及体外表达的rHmα-actinin 1重组蛋白。鼠多抗和单克隆抗体分别作一抗经IFA检测显示该蛋白主要分布于虫体的胞质内,其中,传代致弱株中该蛋白的表达量明显减少,只能在虫体质膜附近检测到荧光信号,鼠多抗和单克隆抗体的检测结果一致。3.火鸡组织滴虫rHmα-actinin 1蛋白的免疫保护效果分析将重组蛋白与弗氏佐剂混合后进行乳化,制备亚单位疫苗。重组蛋白设置四个不同剂量组,分别为200、150、100、50 μg/羽,同时设置未免疫攻虫组、未免疫未攻虫组及佐剂对照组,各免疫组于5、12 d免疫,除未免疫未攻虫组,在19 d时经泄殖腔攻虫,剂量3×105个/300μL/羽。通过死亡率、平均增重、病变记分、体液免疫抗体水平、细胞免疫水平等,对重组蛋白的免疫保护效果进行分析。死亡率结果显示,各组鸡均无鸡只死亡;肝脏的平均病变记分结果显示,除了佐剂对照组、未免疫攻虫组、重组蛋白50 μg组和重组蛋白100 μg组有轻微病变外,其它组均无病变产生;在盲肠病变记分方面,佐剂对照组和未免疫攻虫组的病变最为严重,均高于重组蛋白免疫组,其中重组蛋白150 μg组的病变记分最低,且显著低于其他重组蛋白免疫组、佐剂对照组和未免疫攻虫组（p＜0.05）,其次为重组蛋白200 μg组。平均增重分析结果显示,各试验组的平均增重1无差异,说明免疫过程未对鸡群产生体重方面的不良影响;而平均增重2,重组蛋白150 μg组的增重最高,且与未免疫未攻虫组无明显差异（p＞0.05）,其次为重组蛋白100 μg组和重组蛋白200 μg组。细胞免疫水平显示,在一免前（5 d）各试验组鸡IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10水平相近,随着免疫时间和免疫次数的增加,IFN-γ和IL-2呈现出增高趋势,而IL-4和IL-10呈下降趋势,各试验组相比,重组蛋白200μg最佳,其次重组蛋白150μg组。抗体水平显示,一免后7d（12d）,各免疫组的抗体水平与免疫前相比,未出现明显变化。而免疫后7 d（19 d）,重组蛋白免疫组的抗体水平明显高于佐剂对照组、未免疫未攻虫组、未免疫攻虫组（p＜0.05）,其中150μg组的抗体水平最高,且显著高于其他重组蛋白免疫组（p＜0.05）。综合病变记分、平均增重、细胞免疫和体液免疫抗体水平分析,重组蛋白150 μg组的免疫保护效果最佳,进而为抗禽组织滴虫病亚单位疫苗的研制提供了新靶点和新策略。