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丝氨酸蛋白酶(Serine Proteases,SPs)是一类以丝氨酸为活性中心的重要的蛋白水解酶,主要包括胰蛋白酶(EC号:3.4.21.4)和胰凝乳蛋白酶(EC号:3.4.21.1)。丝氨酸蛋白酶是鳞翅目昆虫中最主要的消化酶,约占鳞翅目昆虫中肠总消化酶活性的95%,在鳞翅目昆虫的生理过程以及生长发育过程中起着重要的作用,主要参与食物消化、蜕皮过程和先天免疫反应等重要的生理过程。此外,一些研究证明,鳞翅目昆虫中肠丝氨酸蛋白酶参与Bt原毒素活化和毒素降解过程,昆虫对Bt产生抗性有可能依赖于昆虫肠道中丝氨酸蛋白酶表达水平或类型(例如胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶)的变化。因此鳞翅目昆虫中肠的丝氨酸蛋白酶一直是研究的热点,逐渐成为害虫防治的靶标,为新一代杀虫剂的研发提供了一个方向。粘虫Mythimna separata是亚洲国家粮食作物的重大害虫,为了探索丝氨酸蛋白酶在粘虫体内的作用,本研究从粘虫幼虫中肠克隆得到一条胰蛋白酶类丝氨酸蛋白酶基因和一条胰凝乳蛋白酶类丝氨酸蛋白酶基因,分别命名为MsT(GenBank登录号:KP730443)和MsCT(GenBank登录号:KP730444),并将MsT和MsCT基因进行了原核表达和活性测定。同时,对MsT基因和MsCT基因在不同组织和不同发育阶段的转录水平,对于饥饿处理及再喂食后的转录反应,对于蜕皮激素(20E)的转录反应以及对于Cry1AC原毒素的转录反应都做了研究。最后,通过注射双链RNA检测了MsT和MsCT基因的RNA干扰效果。主要研究结果如下:1.MsT基因cDNA序列长856 bp,开放阅读框(ORF)长765 bp,编码255个氨基酸,蛋白质分子量为27.1 kDa,等电点为9.04。由MsT推导出的氨基酸序列与鳞翅目昆虫丝氨酸蛋白酶的氨基酸序列一致性在50%~84%之间,其中与蓓带夜蛾Mamestra configurata(GenBank登录号:ACR15970)胰蛋白酶类丝氨酸蛋白酶的氨基酸序列一致性最高,达84%。2.MsCT基因cDNA序列长971 bp,开放阅读框(ORF)长891 bp,编码297个氨基酸,蛋白质分子量为31.0 kDa,等电点为8.63。由MsCT推导出的氨基酸序列与鳞翅目昆虫丝氨酸蛋白酶的氨基酸序列一致性在44%~84%之间,其中与蓓带夜蛾M.configurata(GenBank登录号:ACR15972)胰凝乳蛋白酶类丝氨酸蛋白酶的氨基酸序列一致性最高,达84%。3.分别构建重组载体MsT-pET21b和MsCT-pET21b转化到大肠杆菌菌株E.coli BL21中进行原核表达,经过SDS-PAGE和Western blot检测确定为目的蛋白。蛋白可溶性分析发现重组蛋白为包涵体。将重组蛋白经过变性、纯化和复性处理后,以BApNA为底物,进行活性测定。结果表明,在Tris-HCl缓冲液中,重组蛋白的活性随着p H的提高而增大,到pH为9.5时,活性达到23.24 U/mL;在Glycine-Na OH缓冲液中,重组蛋白的活性随着p H的变化先升高后降低,在p H为10.0时,活性达到最高,为35.74 U/mL。4.明确了MsT和MsCT基因在粘虫不同组织和不同发育阶段的转录水平。结果发现在粘虫的前肠、中肠、马氏管、脂肪体和围食膜都发现了MsT和MsCT基因的转录,特别是在围食膜中,它们的转录水平达到最高;MsT和MsCT基因都主要在末龄幼虫、预蛹和蛹的阶段表达,MsT基因在蛹期表达量最高,而MsCT基因在末龄幼虫、预蛹和蛹期表达量相差不大。5.明确了Ms T和MsCT基因对于饥饿处理及再喂食后的转录反应。结果发现饥饿处理24h后,MsT和MsCT基因的表达量都明显降低;同时,饥饿处理的幼虫通过再次喂食后,MsT和MsCT基因的表达量又显著升高。这些结果表明,Ms T和MsCT基因可能在粘虫的食物消化过程中起到某种作用。6.明确了Ms T和MsCT基因对于蜕皮激素(20E)的转录反应。结果发现与对照相比,MsT基因的表达量在6龄幼虫注射2μg蜕皮激素12 h后显著升高,在24 h后表达量达到最高;而Ms CT基因的表达量在注射2μg蜕皮激素24 h后显著降低。这些结果表明,Ms T基因可能在粘虫的蜕皮过程中起到某种作用。7.明确了MsT和MsCT基因对于Cry1AC原毒素的转录反应。结果发现与对照相比,MsT基因的表达量不受Cry1Ac原毒素的影响,而MsCT基因的表达量在3龄幼虫喂食用Cry1Ac原毒素浸泡过的玉米叶24 h后显著升高。这些结果表明,MsCT基因可能在Bt原毒素的活化过程中起到某种作用。8.MsT和MsCT基因的RNA干扰研究表明,粘虫4龄幼虫注射4 ul含4ug的dsMsT和dsMsCT后,MsT和MsCT基因的转录水平在12 h后分别降低了76.69%和86.16%,且沉默效果在48 h后依然存在。同时,注射dsMsT和dsMsCT后,粘虫4龄幼虫的死亡率分别为26.66%和32.22%。