背景和目的创伤弧菌(Vibrio vulnificus)是革兰阴性嗜盐弧菌，广泛存在于海产品中，尤以牡蛎中多见。创伤弧菌感染是新发传染病之一，Thorsteinsson等(1974)首先报道了3例创伤弧菌引起的人类原发性败血症，1979年Farmer等予以命名。日本、北美和中东地区以及我国浙江、广东、台湾等沿海地区常有创伤弧菌感染的病例报告。创伤弧菌感染以原发性败血症和创口感染最为常见，此外还可引起胃肠炎、肺炎、脑膜炎、角膜炎等。创口感染和原发性败血症发病急、进展快，若不及时采取针对性治疗措施，约50％创口感染患者须截肢以保全生命，50～80％原发性败血症患者发病后数天内死亡。因此，创伤弧菌感染早期、快速诊断极为重要，但目前国内尚无相关临床实验室诊断方法及其产品。该菌分类上属于弧菌属第5群，分为三个生物型，其中Ⅰ型和Ⅲ型对人机会致病，Ⅱ型仅对鳗鱼致病，Ⅲ型对人有强致病性。不同地区及病种患者标本中分离的创伤弧菌染色体上均携带vvhA基因，故vvhA基因是用于临床实验室检测人类创伤弧菌感染的靶标。实时荧光定量PCR具有快速、特异和敏感等优点，尤其适合于创伤弧菌感染临床标本检测的需要。本研究在常规PCR检测创伤弧菌vvhA基因的基础上，建立了检测vvhA基因的TaqMan实时荧光定量PCR以指导临床及时采取正确的应对措施减少患者截肢和死亡率。材料与方法创伤弧菌临床菌株WZ01株系温州医学院本课题组成员从患者标本中分离并鉴定。使用细菌基因组DNA抽提试剂盒(BioColor)提取细菌DNA，参考文献以生物学软件Primer Express设计针对vvhA基因的保守序列的引物和一条探针，分别以FAM和TAMRA标记探针的5’端和3’端。通过pMD19-T载体与PCR扩增所得的vvhA片段连接反应，形成重组质粒pMD19-T-vvhA100，将构建的重组质粒pMD19-T-vvhA100转染感受态E．coli DH5α中。提取含有pMD19-T-vvhA100重组质粒，将重组质粒梯度稀释浓度为1×10~2～1×10~7作为阳性模板。通过对重组质粒的测定来检测方法的灵敏度；通过对大肠杆菌、伤寒沙门菌、绿脓杆菌、志贺痢疾杆菌、产气肠杆菌、金黄色葡萄球菌、普通变形杆菌、霍乱弧菌的检测来验证方法的特异性。由于创伤弧菌感染病人的临床标本不易获得，为模拟临床发生的创口感染和败血症实验中我们构建腹腔注射、皮下注射、灌胃三种方式感染创伤弧菌的ICR小鼠模型，以1×10~5CFU，1×10~6CFU and 1×10~7CFU三个创伤弧菌的浓度去感染小鼠，运用建立的TaqMan实时荧光定量PCR方法来检测不同感染途径小鼠的血液、肠内容物、皮下感染组织标本。结果设计的引物能够很好的扩增vvhA基因目的片段；为了获得创伤弧菌vvhA基因TaqMan实时荧光定量PCR检测的阳性对照，我们构建了含vvhA基因100 bp目的扩增片段的重组质粒，测序结果表明所克隆的vvhA基因100 bp片段核苷酸序列与报道的相关序列相似性为100％，作为阳性对照实际使用时取得良好效果。建立的vvhA基因TaqMan实时荧光定量PCR仅对创伤弧菌DNA有阳性检测结果，对大肠杆菌、伤寒沙门菌、绿脓杆菌、志贺痢疾杆菌、产气肠杆菌、金黄色葡萄球菌、普通变形杆菌、霍乱弧菌DNA检测结果均为阴性，表明该方法有较高的检测特异性。为提高反应的扩增效率及灵敏度，即获得最小Ct值和最高△Rn值，我们采用矩阵法对TaqMan实时荧光定量PCR体系中所采用的引物和探针浓度比例进行了优化，优化后的Ct值减少了5.51、△Rn荧光强度由0.6增长至1.1左右。实验采用所建立的vvhA基因TaqMan实时荧光定量PCR，可有效地检出可检测出0.01 ng创伤弧菌DNA或1×10~3拷贝数pMD19-T-vvhA100，不同浓度pMD19-vvhA100三次检测结果的SD＜0.79，PCR仅可检出1 ng创伤弧菌DNA或1×10~5及以上拷贝数pMD19-T-vvhA100。创伤弧菌小鼠感染模型检测结果显示腹腔感染组和皮下感染组小鼠在12小时内死亡；灌胃感染组及对照组则在12小时内存活。腹腔感染组和皮下感染组小鼠血液和皮下组织标本创伤弧菌vvhA基因均为阳性，灌胃感染组血液和肠内容物均为阴性。结论实验所建立的刨伤弧菌vvhA基因TaqMan实时荧光定量PCR具有快速、稳定、敏感、特异等优点，适合用于临床实验室进行创伤弧菌引起的败血症和创口感染快速诊断。