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肝纤维化（liver fibrosis/hepatic fibrosis）是各种慢性肝病向肝硬化发展所共有的病理改变和必经途径，虽是可逆的病理过程，但治疗上仍缺乏有效、副作用小的药物。导师李佃贵教授首创了中医“浊毒”理论，他经多年临证认为，浊毒内蕴是肝纤维化的主要病机之一。以化浊解毒法为指导，选用中药组成化浊解毒方治疗肝纤维化取得了满意的疗效，但其治疗机制尚未明确。肝星状细胞（hepatic stellate cell,HSC）作为成纤维细胞/肌成纤维细胞的主要来源，是肝纤维化发生发展的中心环节，细胞外基质(extracellular matrix, ECM）的合成与降解失衡是肝纤维化的主要病理改变。多种细胞因子、生长因子、趋化因子是肝纤维化的关键因子，多条信号通路参与了肝纤维化的调控过程，它们被确认为肝纤维化形成的重要靶点。本论文分三个部分，从体内、体外不同水平上选取部分关键靶点，观察了化浊解毒方抗肝纤维化的作用和机制，为化浊解毒法和“浊毒”理论治疗肝纤维化提供了依据。第一部分化浊解毒方经JAK/STAT通路抑制DMN致大鼠肝纤维化的作用研究目的：通过观察化浊解毒法组方对二甲基亚硝胺（DMN）致大鼠肝纤维化模型中肝组织Ⅰ型胶原蛋白（ColⅠ)、Ⅲ型胶原蛋白（ColⅢ) mRNA以及JAK2/STAT3蛋白的表达情况，评价化浊解毒方对大鼠肝纤维化的调节作用，探讨其可能的作用机制。方法：清洁级SD雄性大鼠70只，分为4组，即：正常对照组（A组）、模型对照组（B组）、复方鳖甲软肝片组（C组）、化浊解毒方组（分为等效、二倍、四倍剂量组，即D1、D2、D3组）、，除A组外,各组均予1%DMN10mg/kg腹腔内注射，实验第1周连续造模3天，第2到6周，每周连续造模2天，第5到8周，每天等体积灌胃给与不同药物。第8周末处死大鼠并取新鲜肝组织，用Masson染色观察肝组织病理情况；运用RT-PCR法检测肝组织中ColⅠ、ColⅢmRNA的表达；用Western-blot法检测JAK2/STAT3蛋白表达情况。结果：1肝组织及病理学情况观察：肉眼观察A组大鼠肝脏表面光滑、质韧，色鲜红；B组大鼠肝脏表面有颗粒状结节，质硬；D2组受试大鼠肝脏表面散在细砂粒样结节，质稍硬，色暗红。Masson染色情况显示：A组大鼠肝小叶结构完整，肝索排列整齐；B组纤维纵膈较多，纤维组织增粗、包绕肝小叶；D1、D2和C组纤维纵膈均较B组减轻，纤维条索变细；D3组纤维条索较粗。2化浊解毒方对大鼠肝组织中ColⅠ、Col ⅢmRNA表达的影响：与A组相比，B组ColⅠ、Col Ⅲ表达均明显增多（P <0.01)。与B组相比， C及D1组ColⅠ、Col Ⅲ表达均降低（P <0.05)；D2组ColⅠ、Col Ⅲ表达显著降低（P <0.01)；D3组ColⅠ、Col Ⅲ表达降低不明显（P>0.05)。3化浊解毒方对大鼠肝组织中JAK2、STAT3蛋白表达的影响：与A组相比，B组JAK2、STAT3蛋白表达均明显增多（P <0.01)。与B组相比，D1组JAK2蛋白表达降低（P <0.05)；C、D2组JAK2蛋白表达显著降低（P <0.01)；除C组外，各给药组STAT3蛋白表达较B组差异均无统计学意义（P>0.05)。结论：化浊解毒方能够改善DMN致大鼠肝纤维化的程度，可以不同程度的改善肝纤维化大鼠肝组织ColⅠ、ColⅢ的情况，以二倍剂量效果最为明显。通过降低JAK2蛋白表达，从而调节JAK2/STAT3通路，可能是其发挥抗肝纤维化的作用机制之一。第二部分化浊解毒方调节PDGF、CTGF、MCP-1和IL-13抑制DMN致大鼠肝纤维化的作用研究目的：通过观察以化浊解毒法组方对DMN致大鼠肝纤维化模型中肝组织血管内皮生长因子-BB（PDGF-BB）、血清中转化生长因子-β1（TGF-β1）、结缔组织生长因子（CTGF）、单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）和白细胞介素-13（IL-13）含量的影响，探讨化浊解毒方经细胞因子抗肝纤维化的作用和机制。方法：运用RT-PCR法检测肝组织中PDGF-BB mRNA的表达，运用ELISA法检测大鼠血清中CTGF、MCP-1、IL-13的含量。结果：1化浊解毒方对大鼠肝组织PDGF-BB mRNA表达的影响：与A组比较，B组PDGF-BB mRNA的表达显著增加（P <0.01）；与B组比较，C、D1组PDGF-BB mRNA表达均降低（P <0.05）；D2组的PDGF-BB mRNA降低更为显著（P <0.01）；D3组与B组PDGF-BB mRNA的表达差异无统计学意义（P>0.05）；D3组PDGF-BB mRNA的表达较D2组显著升高（P <0.01）。2化浊解毒方对大鼠血清中CTGF含量的影响：与A组相比，B组CTGF含量增多（P <0.05)；与B组相比，各给药组大鼠血清CTGF含量均降低（P <0.05)；与C组相比，D3组含量有增多趋势，但无统计学意义（P=0.063>0.05)；D2组CTGF含量较C组、D1、D3组均降低（P <0.05)。3化浊解毒方对大鼠血清中MCP-1含量的影响：与A组相比，B组MCP-1表达明显增多（P <0.01)；与B相比，除D3组外（P>0.05)，各治疗组MCP-1含量均明显降低（P <0.01)；C组MCP-1含量较D1、D3组降低（P <0.01，P <0.05)。4化浊解毒方对大鼠血清中IL-13含量的影响：与A组相比，B组IL-13含量明显增多（P <0.01)；与B组相比，各给药组大鼠血清IL-13含量均明显降低（P <0.01)；C组IL-13含量较D3组显著降低（P <0.01)；D2组IL-13含量与D1、D3组相比显著降低（P <0.01，P <0.05)。结论：化浊解毒方可减少DMN致肝纤维化大鼠肝组织中PDGF-BB的表达及血清中CTGF、MCP-1、IL-13的含量，推测上述细胞因子是化浊解毒方抗肝纤维化的作用靶点之一。第三部分化浊解毒方含药血清经MAPK及PI3K/AKT通路抑制大鼠HSC活化的作用研究目的：运用血清药理学方法观察大鼠HSC中p-p38、p-JNK、PI3K及p-AKT蛋白的表达，评价化浊解毒方大鼠含药血清对MAPK、PI3K/AKT信号转导通路的作用，探讨化浊解毒方抗肝纤维化可能的分子水平作用机制。方法：选取健康成年雄性SD大鼠，按分组要求灌胃给予相应药物10天后制备含药血清，分为：正常对照组（A组）、模型对照组（B组）、阳性对照组（C组）、化浊解毒方含药血清等效剂量(D1)和二倍剂量（D2）组，B、C、D1、D2组均先行加入TGF-β1干预。各组加入相应血清培养48h后，利用Western-blot法检测p-p38、p-JNK、PI3K及p-AKT蛋白的表达。结果：1p-p38蛋白的表达：与A组比较，B组p-p38蛋白的表达明显增强（P <0.05）；与B组比较，各给药组p-p38蛋白表达显著降低（P <0.05）；与C组比较，D1组p-p38蛋白表达有增高趋势，但差异无统计学意义（P=0.051>0.05），D2组较C组及D1组p-p38蛋白表达均降低（P <0.05）。2p-JNK蛋白的表达：与A组比较，B组p-JNK蛋白的表达增强（P <0.05）；与B组比较，各给药组p-JNK蛋白的表达降低（P <0.05）。与C组比较，D1、D2组p-JNK蛋白的表达均降低（P <0.05）；D2组p-JNK蛋白的表达低于D1组（P <0.05）。3PI3K蛋白的表达：与A组比较，各受试组PI3K蛋白表达均升高（P<0.05）；与B组比较，D2组PI3K蛋白表达显著降低（P <0.01）；D2组PI3K蛋白表达低于C组和D1组（P <0.05）。4p-AKT蛋白的表达：与A组比较，各受试组p-AKT蛋白的表达升高（P <0.05）；各给药组p-AKT蛋白表达均较B组降低，差异有统计学意义（P <0.05），其中D2组差异有显著性（P <0.01）；D2与D1组比较，p-AKT蛋白表达降低，（P <0.05）。结论：化浊解毒方含药血清能够降低p-p38、p-JNK、PI3K、p-AKT蛋白在TGF-β1诱导的HSC中的表达，从而调控p38、JNK及PI3K/AKT信号通路的传导，推测化浊解毒方发挥抗肝纤维化的分子水平作用机制与调节MAPK及PI3K/AKT信号通路有关。