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Ⅱ型糖尿病（TypeⅡdiabetesmellitus，T2DM）是一种由于胰岛素抵抗导致的慢性代谢疾病，其发病率逐年上升。研究表明，胰高血糖素样肽-1（Glucagon-like peptide-1，GLP-1）和葡萄糖依赖性促胰岛素激素（Glucose-dependent insulinotropicpolypeptide，GIP）在调节胰岛素和胰高血糖素分泌中起到重要作用。GLP-1和GIP会被二肽基肽酶-IV（Dipeptidyl peptidase-IV，DPP-IV，EC3.4.14.5）降解为无活性功能的片段，影响血糖调节。有效抑制DPP-IV酶活力是治疗Ⅱ型糖尿病的重要手段之一。
本研究从猪肾脏中分离纯化DPP-IV，并以DPP-IV作为工具酶，从牡蛎酶解产物中分离纯化DPP-IV抑制肽，分析抑制肽与DPP-IV之间的作用机理。
首先利用酸沉淀、硫酸铵盐析和凝胶过滤层析相结合的方法，从猪肾脏中分离纯化得到DPP-IV。结果显示，纯化的DPP-IV是分子量约为110kDa的糖蛋白，2D-PAGE显示该酶的等电点约为6.1。肽质量指纹图谱表明获得20个肽段，共296个氨基酸残基，与Sus scrofa的氨基酸序列同源性为100%。DPP-IV二级结构中α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲的占比分别为6.8%、52.5%、16.6%和29%。在60℃以下的温度范围内，DPP-IV的二级结构稳定，随着温度的升高，α-螺旋、β-折叠和β-转角的百分比含量均增加，无规则卷曲的百分比含量减少，表明DPP-IV的二级结构发生改变。DPP-IV在60℃以下，pH4.0~10.0范围均能保持高酶活力，具有良好的热稳定性和pH稳定性。DPP-IV的热变性温度（Denaturation temperature，Td）为72.8±0.2℃。DPP-IV内源荧光光谱在60℃以下不发生改变，在70℃时内源荧光增强。在pH5.0~9.0的范围内，内源荧光较为稳定，而在pH4.0以下和高于pH10.0时的荧光强度降低，发生荧光猝灭。Zn2+和Ca2+对DPP-IV有抑制作用，IC50值分别为126.47±1.80μmol/L和48.08±0.23mmol/L，且不改变DPP-IV二级结构。随着Zn2+和Ca2+浓度的增加，DPP-IV内源荧光强度先增加后降低。
以DPP-IV作为目标酶，太平洋牡蛎（Crassostrea gigas）为原料，优化酶解条件制备抑制肽。采用胰酶在pH8.0、加酶量为0.8%和酶解时间为90min酶解牡蛎肉制备的酶解液对DPP-IV的抑制活性最高。利用3kDa超滤膜、Sephadex G-15凝胶层析和RP-HPLC对酶解液进行分离，经质谱鉴定和BIOPEP-UWM模拟胃肠液消化，得到APSTM和ILAPPER两个肽段。DPP-IV抑制活性的体外分析结果显示，APSTM和ILAPPER的IC50值分别为354.81±20.00μmol/L和16.98±1.29μmol/L。经体外模拟胃肠液消化，APSTM和ILAPPER具有良好的消化稳定性。体外抑制DPP-IV实验表明，APSTM会被DPP-IV降解，而ILAPPER不会被DPP-IV降解。
进一步探究DPP-IV抑制肽的作用机制。抑制动力学结果表明APSTM和ILAPPER的抑制类型为竞争/非竞争混合型抑制和竞争性抑制。差示扫描荧光（Differential scanning fluorometry，DSF）结果表明APSTM和ILAPPER这两个抑制肽提高DPP-IV的熔解温度（Melting temperature，Tm），分别提高了1.83℃和7.62℃。分子对接结果显示，这两种抑制肽与DPP-IV的S1和S2口袋的Arg125，Glu205，Glu206、Tyr662等关键氨基酸形成氢键，ILAPPER与催化中心Ser630、His740形成氢键，因而具有更好的抑制效果。
本研究简化了从猪肾脏中制备DPP-IV的步骤，可快速为探究DPP-IV抑制肽提供目标酶。酶法制备牡蛎DPP-IV抑制肽及其作用机制的研究，为以牡蛎为原料的海洋功能性食品的开发利用提供了理论基础。
本研究从猪肾脏中分离纯化DPP-IV，并以DPP-IV作为工具酶，从牡蛎酶解产物中分离纯化DPP-IV抑制肽，分析抑制肽与DPP-IV之间的作用机理。
首先利用酸沉淀、硫酸铵盐析和凝胶过滤层析相结合的方法，从猪肾脏中分离纯化得到DPP-IV。结果显示，纯化的DPP-IV是分子量约为110kDa的糖蛋白，2D-PAGE显示该酶的等电点约为6.1。肽质量指纹图谱表明获得20个肽段，共296个氨基酸残基，与Sus scrofa的氨基酸序列同源性为100%。DPP-IV二级结构中α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规则卷曲的占比分别为6.8%、52.5%、16.6%和29%。在60℃以下的温度范围内，DPP-IV的二级结构稳定，随着温度的升高，α-螺旋、β-折叠和β-转角的百分比含量均增加，无规则卷曲的百分比含量减少，表明DPP-IV的二级结构发生改变。DPP-IV在60℃以下，pH4.0~10.0范围均能保持高酶活力，具有良好的热稳定性和pH稳定性。DPP-IV的热变性温度（Denaturation temperature，Td）为72.8±0.2℃。DPP-IV内源荧光光谱在60℃以下不发生改变，在70℃时内源荧光增强。在pH5.0~9.0的范围内，内源荧光较为稳定，而在pH4.0以下和高于pH10.0时的荧光强度降低，发生荧光猝灭。Zn2+和Ca2+对DPP-IV有抑制作用，IC50值分别为126.47±1.80μmol/L和48.08±0.23mmol/L，且不改变DPP-IV二级结构。随着Zn2+和Ca2+浓度的增加，DPP-IV内源荧光强度先增加后降低。
以DPP-IV作为目标酶，太平洋牡蛎（Crassostrea gigas）为原料，优化酶解条件制备抑制肽。采用胰酶在pH8.0、加酶量为0.8%和酶解时间为90min酶解牡蛎肉制备的酶解液对DPP-IV的抑制活性最高。利用3kDa超滤膜、Sephadex G-15凝胶层析和RP-HPLC对酶解液进行分离，经质谱鉴定和BIOPEP-UWM模拟胃肠液消化，得到APSTM和ILAPPER两个肽段。DPP-IV抑制活性的体外分析结果显示，APSTM和ILAPPER的IC50值分别为354.81±20.00μmol/L和16.98±1.29μmol/L。经体外模拟胃肠液消化，APSTM和ILAPPER具有良好的消化稳定性。体外抑制DPP-IV实验表明，APSTM会被DPP-IV降解，而ILAPPER不会被DPP-IV降解。
进一步探究DPP-IV抑制肽的作用机制。抑制动力学结果表明APSTM和ILAPPER的抑制类型为竞争/非竞争混合型抑制和竞争性抑制。差示扫描荧光（Differential scanning fluorometry，DSF）结果表明APSTM和ILAPPER这两个抑制肽提高DPP-IV的熔解温度（Melting temperature，Tm），分别提高了1.83℃和7.62℃。分子对接结果显示，这两种抑制肽与DPP-IV的S1和S2口袋的Arg125，Glu205，Glu206、Tyr662等关键氨基酸形成氢键，ILAPPER与催化中心Ser630、His740形成氢键，因而具有更好的抑制效果。
本研究简化了从猪肾脏中制备DPP-IV的步骤，可快速为探究DPP-IV抑制肽提供目标酶。酶法制备牡蛎DPP-IV抑制肽及其作用机制的研究，为以牡蛎为原料的海洋功能性食品的开发利用提供了理论基础。