[目 的]建立一种高效简便的原代神经元氧糖剥夺模型,在体外实验中,研究灯盏花乙素(Scutellarin,Scu)对神经元 OGD(oxygen/glucose-deprived)损伤后存活率的影响,确定其有效保护浓度的范围;检测相关凋亡信号通路研究灯盏花乙素对神经元OGD损伤后可能的保护机制;研究灯盏花乙素在神经元OGD损伤后对CX3CR1是否具有调节作用;在原代神经元OGD损伤模型上研究CX3CR1的表达情况,并进一步探讨CX3CR1对神经元OGD损伤过后的影响及其调节作用机制。[方 法]取24 h内出生的C57BL/6小鼠皮层,用剪碎、消化、吹打、过滤获得细胞悬液,接种在多聚赖氨酸包被的35mm培养皿里,4 h后换成神经元完全培养基,48 h后用阿糖胞苷进行纯化,72 h后换液,以后每3天半量换液,培养至第9天等神经元成熟后进行实验。用神经元特异性标记物MAP-2对神经元进行鉴定,从而获得纯度可靠的神经元。用MTT法检测Scu对OGD损伤后神经元的活性的影响,明确Scu对神经元的保护作用和最佳有效浓度。神经元氧糖剥夺法(OGD)模型的建立:原代神经元培养至第9天,在显微镜下观察神经元形态良好,将神经元分为4组:Con、OGD、OGD+辅料、OGD+Scu。用Scu和Scu辅料预处理30 min,然后需要进行OGD处理的组换为无糖Neurobasal-A,放入缺氧小室里面缺氧15 min,缺氧结束后收取细胞蛋白用于后续 Western Blotting 实验。PC-12细胞氧糖剥夺法(OGD)模型的建立:将PC-12细胞按合适密度接种在6孔板里,用高糖DMEM+10%FBS的培养基进行培养。待细胞成熟后将需要进行OGD处理的细胞换成无糖DMEM,然后放进缺氧小室里面缺氧15 min,缺氧结束后收集蛋白进行Western Blotting实验。Western Blotting:将神经元培养至成熟后随机分为Con、OGD、OGD+辅料、OGD+Scu四组,用Scu最佳有效浓度处理30min,然后建立OGD模型,收集蛋白,用 Western Blotting 检测 CX3CR1、cleaved-PARP、cleaved-Caspase3、ASK-1、P-P38、Bcl-2的表达情况,分析Scu对神经元的保护作用及机制;将PC-12细胞分为四组:Con、Con+CX3CR1siRNA、OGD、OGD+CX3CR1siRNA,用 lip2000将CX3CR1基因序列的siRNA转染进PC-12细胞,24h后建立OGD模型,收集细胞蛋白,用 Western Blotting 检测 CX3CR1、cleaved-PARP、cleaved-Caspase3、ASK-1、P-P38的表达情况,检测沉默掉CX3CR1基因对细胞凋亡的影响。[结果]原代神经元鉴定:神经元培养至第9天细胞形态良好,用DAPI和MAP-2双重染色法对神经元进行鉴定,结果显示,与未加阿糖胞苷组相比,加阿糖胞苷组神经元的纯度显著提高(p<0.05)。MTT检测:与Con相比OGD后神经元的存活率显著降低(p<0.05)。与OGD组相比,用浓度为80nmol.L-1-160 nmol.L-1 Scu预处理30min可以显著提高OGD后神经元的存活率(p<0.05),Scu 40nmol.L-1对神经元的保护作用并不明显。形态学观察:OGD后神经元胞体膨胀、通透性降低,视野中细胞碎片增多。而经过Scu预处理后,神经元轴突较完整,视野中细胞碎片明显减少,崩解细胞不明显,这说明Scu可以对神经元起到保护作用。Western Blotting:在神经元OGD 模型上,与 Con 组相比,OGD 组 cleaved-caspase3、cleaved-PAR,ASK-1、P-P38 显著升高(*p<0.05),Bcl-2 显著降低(*p<0.05);与 OGD 组相比,OGD+Scu组 cleaved-caspase3、cleaved-PARP、ASK-1、P-P38 显著降低(*p<0.05),Bcl-2显著升高(*p<0.05)。在PC-12细胞OGD模型上,用CX3CR1基因序列的siRNA转染PC-12细胞24 h后收集蛋白,结果显示,与Con组相比,Con+CX3CR1siRNA组CX3CR1的表达显著降低,差异具有统计学意义(p<0.05)。与Con组相比,OGD 后 CX3CR1、cleaved-caspase3、cleaved-PARP、ASK-1、P-P38 显著升高,差异具有统计学意义(*p<0.05);与OGD组相比,OGD+CX3CR1siRNA组的CX3CR1、cleaved-PARP、ASK-1、P-P38显著降低,差异具有统计学意义。(*p<0.05)(**p<0.01)。[结 论]1:成功建立了一种高效简便的原代神经元氧糖剥夺模型2:灯盏花乙素在体外能明显抑制脑缺血后的神经元的凋亡。3:神经元上CX3CR1具有功能性表达,灯盏花乙素可以通过调节CX3CR1的表达对神经元起保护作用。4:灯盏花乙素可能是通过ASK-1/P-P38/Bcl-2信号通路来实现脑缺血后对神经元的保护作用。