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研究背景乳腺癌是世界上女性最常见的恶性肿瘤,也是最常见的女性恶性肿瘤死因。2012年全世界新增乳腺癌患者约167万例,占女性恶性肿瘤患者总量的25%;乳腺癌死亡患者约52.19万例,占女性恶性肿瘤死亡患者总量的15%。由于快速城市化及生活方式改变的影响,乳腺癌发病率在世界范围内仍然呈上涨趋势。2015年,中国新增女性乳腺癌患者约26.86万例,占女性恶性肿瘤总量的15.1%;乳腺癌死亡患者约6.95万例,占女性恶性肿瘤死亡总量的6.9%。肿瘤细胞的耐药性导致乳腺癌治疗失败的主要原因。因此,乳腺癌耐药关键因子、作用靶点及调控机制的研究对提高肿瘤细胞的药物敏感性具有重要意义。多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶（poly-ADP-ribose polymerase,PARP）是存在于真核细胞中的一种核酶,含有多种亚型,如:PARP1、PARP2和PARP3等。PARP1首先被发现,它在细胞生理（如基因组稳定性）与病理过程（如恶性肿瘤发生、治疗抵抗）中都发挥着重要作用。许多研究证实PARP1与肿瘤细胞的耐药性关系密切。烷化剂是一种广泛使用的抗肿瘤药物,有一个或多个高度活跃的烷化基团,能和肿瘤细胞的DNA相结合,使得快速生长的肿瘤细胞发生DNA损伤,促进肿瘤细胞凋亡。PARP1是DNA损伤的重要感受器和信号传导器,当DNA发生损伤时,PARP1被激活并参与损伤DNA的修复,而当PARP 1的表达受到抑制时,PARP1介导的损伤DNA修复机制也会受到抑制,因此能够减轻或者逆转肿瘤细胞的烷化剂耐药性。目前,PARP1是最有潜力的抗癌药物分子靶点之一。微小RNA（microRNA,miRNA）是由18-25个核苷酸组成的高度保守的单链非编码的小分子RNA。作为转录后调节因子,miRNA通过碱基互补配对原则与靶mRNA的3’非编码区域（untranslated region,UTR）相结合,可以降低靶mRNA的水平（降解靶mRNA）或降低靶mRNA所编码的蛋白水平（抑制mRNA翻译）。尽管miRNA仅占整个人类基因组的3%,但是miRNA调控着人体20%～30%的mRNA。超过50%的miRNA位于基因组的脆弱位点或参与肿瘤相关基因组区域,因此,miRNAs与肿瘤的关系非常密切。越来越多的证据表明,miRNA在肿瘤发展与治疗抵抗中发挥着关键作用。2013年,Riaz等发现miRNA-891b在BRCA1突变的乳腺癌细胞珠中高表达,提示miRNA-891b可能与DNA损伤修复有关。通过检索 TargetScan数据库（http://www.targetscan.org/vert71/）,我们发现 PARP1 的 3’UTR中可能含有miR-891b的结合位点,提示miR-891b可能参与PARP1表达调控,可能与烷化剂耐药有关。本研究,主要探讨miR-891b对乳腺癌细胞烷化剂药物的敏感性的调节,希望能寻找新的有效靶点。研究目的本研究主要探索miR-891b对乳腺癌细胞HCC1806烷化剂药物敏感性的调节作用,包括三个方面的研究。第一,探究miR-891b与PARP1的靶向作用关系;第二,研究miR-891b对细胞HCC1806药物敏感性的调控作用;第三,探讨PARP1对细胞HCC1806药物敏感性的作用。研究方法第一部分:首先,检索TargetScan数据库,以寻找miR-891b与PARP1的结合位点,然后应用PCR技术扩增该结合位点片段,并将目的基因片段与pmirGLO载体连接,构建PARP1-3’ UTR报告基因载体。然后将PARP1-3’UTR报告基因载体-miR-891b mimics或PARP1-3’UTR报告基因载体-miR-891b NC分别共转染到乳腺癌细胞HCC1806中,利用荧光素酶报告基因分析法检测miR-891b与PARP1-3’UTR的是否具有结合位点。然后利用细胞转染技术分别将miR-891b mimics和miR-891b NC分别转染到乳腺癌细胞HCC1806中,最后使用qRT-PCR检测miR-891b水平变化,Western blot检测PARP1的蛋白表达水平变化。第二部分:在研究miR-891b对细胞HCC1806药物敏感性的调控作用时,首先将miR-891b mimics和miR-891b NC分别转染到细胞HCC1806中,转染48h后,将细胞置于含40μM甲基硝基亚硝基胍（N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine,MNNG）的培养基中,培养1h后将细胞转移到不含MNNG的培养基中培养4天。然后利用MTT法检测miR-891b mimics + MNNG组、miR-891b mimics 组、miR-NC 组和 miR-NC + MNNG 组的细胞增殖情况,利用流式细胞仪检测各组细胞的凋亡。第三部分:为进一步研究PARP1在乳腺癌细胞HCC1806药物敏感性的作用,我们构建了 PARP1表达质粒,并将miR-891b mimics+pBABE 和 miR-891b mimics + PARP1 表达质粒分别共转染到乳腺癌细胞HCC1806中,转染48 h后,将细胞置于含40 μM MNNG的培养基中,培养1h后将细胞转移到不含MNNG的培养基中培养4天。Western blot检测转染后细胞中PARP1的蛋白表达水平,利用MTT法和流式细胞仪分别检测细胞的增殖情况与凋亡情况。研究结果第一部分:通过检索TargetScan数据库,我们发现PARP1中可能含有miR-891b的结合位点。荧光素酶报告基因分析提示,与共转染miR-891b NC+PGL3-PARP1-3’UTR的对照组细胞相比,共转染miR-891b mimics+PGL3-PARP1-3’UTR的实验组细胞中荧光素酶的活性显著降低（P<0.01）。与转染miR-891b NC的对照组细胞相比,转染miR-891b mimics的实验组细胞中的miR-891b的表达水平明显上升。Western blot检测PARP1的蛋白表达水平发现,与转染miR-891b NC的对照组细胞相比,转染miR-891b mimics的实验组细胞中PARP1的蛋白表达水平出现下降。通过对PARP1蛋白表达水平与Tubulin的蛋白表达水平的比值进行统计分析,发现转染miR-891b mimics的试验细胞中PARP1蛋白表达水平与对照相比显著下降（P<0.01）。第二部分:MTT法检测细胞增殖情况发现,miR-NC + MNNG组的乳腺癌细胞HCC1806的增殖活性显著低于miR-NC组,miR-891b mimics + MNNG组的细胞增殖活性低于miR-891b组,miR-891b mimics + MNNG组的细胞增殖活性低于miR-NC + MNNG组。利用流式细胞仪检测乳腺癌细胞HCC1806的凋亡情况,发现miR-891b + MNNG组的细胞凋亡率要显著高于miR-891b组（P<0.01）和 miR-NC + MNNG组（P<0.01）。第三部分:通过Western blot检测PARP1的蛋白表达水平发现,向乳腺癌细胞HCC1806转染miR-891b mimics后,细胞中PARP1的蛋白表达水平显著下降;当向细胞中同时转入PARP1表达质粒时,细胞中PARP1的蛋白表达水平又会恢复。MTT法和流式细胞仪分别检测细胞增殖和凋亡情况发现,与miR-891b mimics组细胞相比,miR-891b + PARP1组细胞的增殖能力恢复,细胞凋亡也显著下降（P<0.01）。研究结论本研究发现miR-891b能够与PARP1的3’UTR靶向结合。在HCC1806细胞中,miR-891b的表达上调能够抑制PARP1的蛋白表达,说明miR-891b能够负向调控PARP1的蛋白表达。MNNG能抑制乳腺癌细胞HCC1806的增殖,过表达miR-891b增强了乳腺癌细胞HCC1806对MNNG的敏感性,促进细胞的凋亡。在过表达miR-891b的细胞中恢复PARP1的表达时,能够降低乳腺癌细胞HCC1806对MNNG的药物敏感性。此研究说明miR-891b能通过靶向沉默PARP1的表达来增加乳腺癌细胞HCC1806对烷化剂MNNG的敏感性,而miR-891b的这种作用类似于PARP1抑制剂,有望用于药物靶点的开发。