戊型肝炎（Hepatitis E，HE）是一种由戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)引起的一种急性、自限性病毒性肝炎，其临床症状与甲型肝炎相似，但最近报道HEV在免疫缺陷或免疫抑制状态可引起慢性肝炎。HEV的传播途径主要是粪-口传播，常见方式是通过污染的水源和食物。我国是HEV的流行区，HE占我国急性病毒性肝炎10%左右，病死率为1.4％－5.3％，在孕妇中的病死率可达20％，这些数据证明，对戊肝的研究和防治是势在必行的。本论文包括了两部分研究内容，第一部分是通过对不同来源的HEV病毒进行比较分析，及细胞培养上清中HEV病毒结构蛋白的分析来探索HEV病毒的结构及组成蛋白；第二部分是应用昆虫细胞表达体系对HEV VLP的表达、提取进行优化，评价此条件下制备的HEV VLP的理化性质，纯度和免疫原性，进而为HEV VLP疫苗的生产制备奠定基础。一、HEV组成和结构的分析由于现有技术无法获取足够含量的HEV病毒，各研究团队通过HEV结构蛋白在体外表达和感染性克隆这两种手段对HEV的结构进行了研究。目前对结构蛋白（ORF2、ORF3蛋白）的研究认为，ORF2蛋白为衣壳蛋白，缠绕并保护HEV RNA，形成病毒颗粒；ORF3蛋白的功能主要是介导病毒出胞，Emerson等人认为ORF3蛋白除此作用外，可能对病毒在细胞间的传播也起到了一定作用。对病毒结构的研究认为：不同来源的病毒具有不同的结构，细胞培养上清中的HEV和血液中的HEV具有相似的结构：ORF2与RNA结合形成核蛋白，ORF3蛋白位于核蛋白表面介导出胞，出胞时病毒盗取细胞的脂膜覆盖于表面；粪便中的HEV病毒由于在排泄过程中，经过胆汁和消化道中各种酶的作用，病毒表面没有ORF3蛋白和脂膜的覆盖。虽然目前对病毒的结构蛋白和结构有一定的认识，由于没有得到足够含量的HEV病毒进行分析，所以对于病毒颗粒中ORF2蛋白是否为糖蛋白还没能达成共识；细胞培养体系中的病毒颗粒表面的脂膜上是否存在有ORF3蛋白，各研究团队也存在争议；同时，病毒在细胞间传播时，结构蛋白和脂膜对于病毒和细胞结合的影响也没有相关的研究。本实验室建立了有效的HEV培养体系，在此基础上，通过超速离心和亲和层析等方法，对体系中病毒颗粒进行了提取和分析，并与粪便中的病毒颗粒进行了比较，确定了培养体系中病毒颗粒表面脂膜的存在。研究结果表明，两种不同来源的HEV在超离纯化时，病毒RNA和ORF2蛋白分别富集于不同的超离层，通过PLC/PRF/5细胞的培养检测体系对各超离层的复制能力进行检测，结果显示，病毒的复制能力与超离层中RNA的含量呈现正相关性，这一结果提示细胞培养上清和粪便中大部分的ORF2蛋白并未结合RNA组装形成病毒颗粒，而是以非颗粒的形式出现在超离的顶层，不具有病毒复制能力。进一步对病毒颗粒所在超离层的密度进行比较发现，不同来源的病毒颗粒在超离中具有不同的沉降速率，而细胞来源的病毒颗粒在脱脂后，沉降速率与粪便中的病毒颗粒沉降速率一致，这一结果表明，细胞培养上清中的病毒颗粒的表面包裹有脂膜。研究进一步对培养系统中的病毒颗粒和ORF2蛋白分别进行分析。研究对培养体系中病毒颗粒在脱脂处理前后与ORF3抗体的亲和能力进行了比较，结果显示脂膜表面仅有少量ORF3蛋白的存在。细胞来源的病毒颗粒在脱脂前与ORF3抗体的亲和率仅为3%，脱脂后升至20%；粪便来源的病毒颗粒脱脂前后没有变化，均为0.03%，说明在细胞来源的病毒表面上，只有少量ORF3蛋白存在于脂膜的表面，粪便来源的病毒表面既没有脂膜的存在，也没有ORF3蛋白的存在。对病毒脱脂和脱ORF3处理前后与细胞结合率进行的比较发现，细胞来源的病毒在脱脂前后与细胞的结合速率在72小时内没有明显变化，而脱去脂膜和ORF3蛋白的细胞来源的病毒和粪便来源的病毒与细胞结合的速率均明显增高。该结果表明，脂膜对病毒与PLC/PRF/5细胞的结合没有影响，而ORF3蛋白则阻碍了这种结合。研究同时对体系中的ORF2蛋白进行了提取和分析，评价了其组装形成病毒颗粒的可能性。通过对ORF2蛋白的分析发现，病毒培养体系中的ORF2蛋白是以糖基化形式存在的88kDa的蛋白，能够结合RNA，并形成RNA-ORF2蛋白复合物。复合物具有一定的结构，能够在超离过程中表现与粪便病毒颗粒相似的沉降速率，这一结果提示，糖基化的88kDa的ORF2蛋白可能是HEV病毒颗粒的组成蛋白。二、ORF2蛋白在昆虫细胞中的表达对天然HEV电镜观察发现：HEV为无胞膜的球形病毒颗粒，90%的颗粒直径为27-34nm。而对HEV VLP的研究表明，它也具有颗粒样的球形结构，电镜观察显示其直径约为27nm，即HEV VLP结构在形态上具有和天然病毒颗粒相似的形态；同时颗粒性结构使VLP在对机体进行免疫时有更强的免疫原性，所以HEVVLP有可能成为更好HEV疫苗。研究将4型HEV ORF2蛋白的126-621aa序列构建于杆状病毒表达载体上，进一步大量感染昆虫细胞后，优化HEV VLP的表达条件，摸索VLP的纯化工艺，并对此工艺条件下制备的VLP进行评价，考察VLP成为候选疫苗，进一步扩大生产的可能性。本研究将构建成功的4型Bacmid-HEV ORF2126-621aa大量感染昆虫细胞，表达HEV VLP。考察病毒感染复数（MOI）、收获时间和感染时细胞浓度等参数对HEV VLP形成的影响，发现在MOI=5，细胞浓度为2.0×106cells/ml时，攻毒后120小时的时候收获细胞，VLP可达到最大收获量，达到0.072mg/ml。研究在对HEV VLP的表达进行监测时发现，ORF2-126-621在昆虫细胞中进行表达时以两种形式出现，VLP颗粒和非VLP蛋白，由于非VLP蛋白没有颗粒性，会降低VLP的免疫原性，所以在表达工艺的优化时减少非VLP的形成，在纯化制备中去除非VLP蛋白。为了分离纯化HEV VLP，利用超声法将细胞破碎，高速离心去除细胞碎片，将混合有非VLP蛋白的细胞裂解液进行超离纯化，超离有效去除没有组装形成VLP结构的非VLP蛋白。为了将样品溶液中高浓度蔗糖去除并为VLP的柱层析纯化做准备，将超离后收获的样品对柱层析的上样缓冲液进行透析，同时在此过程中添加固定剂对VLP进行固定。将处理后的样品进行阴离子交换层析分离，研究发现，阴离子交换介质ANX Sepherose FF能够有效的实现对HEV VLP的分离纯化，经此步骤纯化制备的HEV VLP的电泳纯度由40.4%提高至97.7%，初步达到了精制分离的纯化要求，研究进一步采用了与精制纯化不同分离原理的分析手段（SEC-HPLC）对样品进行了分析，分析结果表明，经此方法制备的HEV VLP纯度达到100%。研究对经过上述优化后的表达和纯化工艺制备的HEV VLP进行了理化性质、纯度和免疫原性的评价，评价表明经此步骤制备的HEV VLP初步具备了HEV候选疫苗的条件，有进一步扩大生产的可能性。综上所述，研究首先对不同来源的HEV病毒结构和组成成分进行了分析，并对各组成成分对病毒与细胞结合速率的影响进行了研究。在此基础上，应用昆虫细胞表达系统对HEV ORF2蛋白进行了表达，优化了HEV VLP的表达和纯化条件，并对经此步骤制备的VLP进行了初步评价，为研制HEV VLP疫苗奠定基础。本研究首次明确了细胞培养产生的HEV病毒颗粒表面仅有少量ORF3蛋白的存在；确定了ORF3蛋白对病毒与PLC/PRF/5细胞结合有阻碍作用，而脂膜对二者结合没有影响；研究首次提出糖基化的ORF2蛋白可能是病毒颗粒中衣壳蛋白的存在形式；另外，本研究还建立了适合于放大至生产规模的HEV VLP的表达、纯化及评价体系。