本文研究目的： 1.观察化疗药对胃癌亲本敏感细胞和耐药细胞的毒性； 2.探讨MAD2蛋白在不同胃癌细胞系AGS、SGC7901和阿霉素耐药细胞SGC7901/ADR中的表达及其意义： 3.探讨MAD2选择性剪切体MAD2β对胃癌细胞生长的调控作用； 4.探讨MAD2在正常胃粘膜组织和胃癌组织中的表达。 研究方法： 一、化疗药对胃癌亲本敏感细胞和耐药细胞的毒性1.通过MTT实验测定细胞对化疗药物的敏感性；2.利用划痕法检测化疗药对肿瘤细胞迁移能力的影响。 二、MAD2蛋白在不同胃癌细胞系和耐药细胞中的表达及其意义。 1.细胞同步化：细胞同步化是指自然的或经人为选择或诱导选择造成的细胞周期同步化，本实验应用自然同步化法获取化疗药物作用后不同时间段的细胞蛋白； 2.MAD2在胃癌耐药细胞与亲本细胞中的差异表达：应用Westernblot技术检测MAD2在胃癌细胞SGC7901及其耐药细胞SGC7901/ADR、AGS细胞中的表达差异； 3.MAD2在细胞内的分布及表达强弱：用细胞免疫组织化学和细胞免疫荧光观察MAD2在胃癌细胞中随细胞周期改变的变化； 4.核型分析和有丝分裂关卡功能实验：用秋水仙素诱导细胞周期停滞于有丝分裂中期，检测有丝分裂中期胃癌细胞染色体数目和形状异常程度，以反映细胞有丝分裂关卡功能。 三、MAD2β对胃癌细胞生长的调控作用。 1.生长曲线绘制：把MTT法检测结果绘制成稳定转染的MAD2β高表达及低表达细胞系及其对照细胞的生长曲线； 2.集落形成实验：用平板集落形成实验检测MAD2β对单细胞增殖能力的影响； 3.细胞迁移能力的检测：用划痕法检测MAD2β是否对肿瘤细胞迁移能力有影响。 四、MAD2在临床胃组织标本中的表达。采用免疫组织化学法检测MAD2在正常胃粘膜组织和胃癌组织中的表达，以了解MAD2与胃癌的进展。 研究结果： 一、化疗药对胃癌亲本敏感细胞和耐药细胞的毒性与SGC7901/ADR细胞相比，SGC7901细胞对化疗药敏感，化疗药作用二者之后SGC7901细胞大多数死亡；而SGC7901/ADR细胞对化疗药耐受，相当数量细胞爬越痕迹线继续生长繁殖。 二、MAD2在胃癌细胞中的表达和意义。 1.MAD2在胃癌亲本敏感细胞和耐药细胞中的表达Westemblot分析发现MAD2在6株胃癌细胞系中均有表达，而在耐药细胞中的表达较胃癌亲本细胞低；在胃癌细胞SGC7901/ADR中，还检测出0.53Kb的剪切体；不同种类胃癌细胞对各种化疗药的敏感性各有差异，在化疗药物作用下亲本敏感细胞SGC7901、AGS中MAD2蛋白表达量明显减少，而SGC7901/ADR中MAD2蛋白表达量变化不明显，且与药物的作用剂量有关；MAD2蛋白在细胞内的表达有一定时间性。 2.MAD2在细胞内的分布及表达强弱MAD2分布以膜核为主，胞浆也有；在间期和有丝分裂前期表达较高，进入中期后表达逐渐降低，直至消失。 3.核型分析和有丝分裂关卡功能实验以永生化胃粘膜上皮细胞GES为正常对照胃粘膜细胞模型，GES细胞核型较稳定；恶性细胞核型分析，染色体畸变、数目不稳定；处于有丝分裂中期的恶性细胞的累积数目明显低于对照细胞，说明恶性细胞的有丝分裂关卡功能下降。 三、MAD2β对胃癌细胞生长的调控。 1.MAD2β抑制胃癌细胞的增殖：MAD2β表达增加后，细胞增殖减慢，细胞数明显减少；siRNA下调MAD2β表达后，细胞生长增快。 2.MAD2β抑制胃癌细胞的集落形成能力：MAD2β表达上调降低SGC7901细胞在普通平板上的集落形成能力；而MAD2β表达下调使SGC7901/ADR细胞的集落形成能力明显增强。 3.MAD2β对胃癌细胞迁移能力的影响：上调MAD2β的表达可以减弱SGC7901细胞的迁移能力。 四、MAD2在临床胃组织标本中的表达。MAD2在胃癌组织中的表达高于正常胃粘膜组织，但低于胃不典型增生组织。MAD2的表达与胃癌组织的分化程度和人群的地区分布无明显差异。 研究结论： 1.胃癌细胞多药耐药性形成过程中MAD2的表达和亚细胞定位都发生了改变，提示MAD2可能参与了胃癌多药耐药的发生。 2.MAD2在胃癌细胞耐药性形成过程中的变化可能和细胞核内化疗药物的浓度、毒性及作用时间均有关。 3.MAD2β可以抑制胃癌细胞的生长，减弱单细胞的集落形成能力和细胞迁移能力，提示MAD2β与肿瘤的恶性表型相关。 4.MAD2在胃癌组织中表达与正常组织中的表达不同，提示它在胃癌发生过程中可能也发挥一定的作用。