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家蚕是一种重要的经济昆虫,同时也是鳞翅目的模式昆虫,在中国已有大约8500年的驯养历史,其生命周期包括卵、幼虫、蛹和成虫四个阶段。在长期的人工选择下,家蚕对不良环境及农药的抗性较弱。由于桑叶受到农药污染而造成家蚕中毒,严重影响我国蚕桑产业的健康发展。氯虫苯甲酰胺是双酰胺类的新型杀虫剂,对鳞翅目昆虫具有广谱性和高效性,被广泛应用于农林害虫防治。家蚕食下被微量氯虫苯甲酰胺污染的桑叶后,其发育和变态均受到影响。为了研究氯虫苯甲酰胺影响家蚕化蛹的原因,本论文以家蚕品种“菁松×皓月”为材料,通过在五龄第3天添食微量氯虫苯甲酰胺(0.01 mg/L)24h,统计对家蚕的生长发育和化蛹变态的影响,检测了 20羟基蜕皮酮(20-hydroxyecdysone,20E)含量及其相关基因的转录水平,并通过数字基因表达谱(Digital gene expression profiling,DGE)分析了表皮差异基因的转录特征,主要研究结果如下:1.氯虫苯甲酰胺在桑叶和蚕体的残留利用高效液相色谱(HPLC)技术分析了氯虫苯甲酰胺在桑叶叶面和家蚕血淋巴中的残留特征,结果表明,氯虫苯甲酰胺在桑叶上的半衰期是5.0 d,在家蚕血淋巴中的代谢半衰期为2.8 d。2.微量氯虫苯甲酰胺添食对家蚕的生物性状的影响本文观察了家蚕暴露于微量氯虫苯甲酰胺24 h出现的中毒症状,统计了家蚕的体重、茧质指标和化蛹率。结果显示,微量氯虫苯甲酰胺处理后,家蚕出现行动缓慢,食桑缓慢的现象,体重在停止添毒48 h后显著降低(P≤0.01),茧层率和结茧率降低,化蛹率为 92.78%(P≤0.05)。3.微量氯虫苯甲酰胺对激素及其信号通路关键基因转录水平的影响为探究微量氯虫苯甲酰胺暴露后家蚕化蛹率降低的原因,通过病理切片和电镜研究了预蛹期的表皮结构,结果表明,微量氯虫苯甲酰胺暴露使得表皮和上皮细胞粘连,出现新旧皮层分离不完全的现象。检测了血淋巴中20E的含量变化,发现20E含量显著降低(P≤ 0.01),20E的合成关键基因CYP302a1,CYP306a1,CYP314a1和CYP315a1的转录水平分别是对照的0.08,0.54,0.31和0.01倍。20E信号通路响应基因EcR,USP,E74和E75的转录水平显著降低(P≤0.05),是对照的56.86%,89.74%,73.82%和35.41%。体外注射20E后,发现蛹表皮可以形成,但不能完成化蛹,推测蛹表皮的形成受阻是由于氯虫苯甲酰胺暴露引起20E水平降低造成的。氯虫苯甲酰胺处理后化蛹变态关键基因Ftz-f1转录水平显著降低(P≤0.01),体外注射20E不能激活Ftz-f1的转录,这可能是不能化蛹的原因。4.微量氯虫苯甲酰胺暴露下家蚕表皮的基因差异表达分析DGE的结果表明,微量氯虫苯甲酰胺暴露后,表皮中的差异表达基因(Differentially expressed genes,DEGs)显著上调表达有 4830 个(P≤0.001),显著下调基因有993个(P≤0.001)。在生物过程GO分类标签中,细胞过程和代谢过程的DEGs分别有361和330个;在细胞组分GO分类标签中,细胞、大分子复合物、膜、膜组分和细胞器分类标签下的DEGs分别有361个、159个、303个、286个和244个;在分子功能GO分类子标签下,结合与催化活性标签下的DEGs分别有492个和449个。基因参与的KEGG代谢通路DEGs最多的两个类别分别是环境信息处理分类标签和代谢子标签,分别有729个和752个差异表达基因。DEGs在包括氧化应激、自噬、凋亡和能量代谢等多个KEGG通路中显著富集,表明化蛹受阻涉及多个生理过程。本文分析了 KEGG能量代谢通路中的海藻糖代谢,通过筛选差异表达基因发现,几丁质合成通路上的第一个酶-海藻糖酶的基因TRE转录水平为对照的0.11倍(P≤0.01),海藻糖合成酶基因TPS的转录水平也仅为对照的0.39倍(P≤0.05),海藻糖代谢及海藻糖供给平衡可直接调控几丁质的合成。另外,调控几丁质合成代谢的关键酶基因GFAT、UAP的转录水平也显著降低(P≤ 0.05)。海藻糖酶活性和海藻糖含量的测定结果表明,在氯虫苯甲酰胺处理后,海藻糖酶活性显著降低(P≤0.001),海藻糖含量是对照108.18%。在微量氯虫苯甲酰胺处理后,海藻糖代谢受阻,海藻糖供给失衡,导致家蚕的表皮几丁质合成受阻,同时几丁质合成酶基因的转录抑制可能是影响蛹表皮几丁质累积,并导致家蚕化蛹变态受阻的原因。综上结果表明,微量氯虫苯甲酰胺暴露,引起20E水平降低和几丁质合成受到抑制,可能是影响蛹表皮形成的作用机制,被抑制转录的Ftz-f1基因可能是引起化蛹变态行为受阻的关键基因。