尿酸氧化酶(Urate Oxidase),又称为尿酸酶(Uricase),是参与生物体内嘌呤降解代谢途径中的一种氧化还原酶。尿酸酶能够催化尿酸转变为尿囊素,尿囊素水溶性高于尿酸,易排出体外。人类在进化过程中尿酸酶基因突变成为假基因,导致尿酸酶丧失活性,如果嘌呤代谢紊乱,产生过量的尿酸或者尿酸排泄机制受阻,血液中尿酸浓度升高,就会引起高尿酸血症。高尿酸血症会引发痛风、心血管疾病、肾脏疾病、中风等并发症,还是肿瘤溶解综合征患者常见的异常代谢之一。因此,引入外源尿酸酶成为治疗高尿酸血症的理想途径。当前,临床使用的尿酸酶药物除了稳定性差,半衰期短,最重要的局限性是具有难以避免的免疫原性。本研究拟通过研究产朊假丝酵母尿酸酶(Candida utilis uricase)的结构特性,对原型尿酸酶进行氨基酸序列改构,再经大肠杆菌诱导表达获得重组尿酸酶,纯化分离后,进行相关结构的验证和研究,为进一步修饰奠定基础。蛋白质的结构与功能密切相关,并且在一定程度上决定了蛋白质的功能,了解蛋白质结构是功能研究的前提。鉴于目前尚无假丝酵母尿酸酶结构的相关报道,本课题采用同源建模得到尿酸酶的三维结构,利用软件分析尿酸酶的结构特性,以提高尿酸酶的稳定性进行序列改构。此外,随着生物信息学的快速发展,一些预测T细胞表位的软件应运而生,在提高尿酸酶稳定性的基础上通过软件预测去除尿酸酶MHC分子抗原结合肽,从而对尿酸酶的序列进一步去免疫化改构。本研究分别合成原型和改构氨基酸序列的尿酸酶基因,克隆到表达载体pET-22b(+)相应酶切位点上,构建大肠杆菌原核表达载体pUOX。转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态,进行诱导表达,成功获得了高效可溶性表达的五种重组尿酸酶,包括原型尿酸酶和四种改构序列的尿酸酶。四种改构的尿酸酶是在原型尿酸酶的基础上一步步进行氨基酸序列改构,分别去掉C末端亮氨酸,249位半胱氨酸改为丝氨酸,同时去掉亮氨酸和改变249位半胱氨酸,在之前的基础上去免疫化改构。由于这五个尿酸酶具有相似的理化性质,首先采用阴离子交换层析初步纯化,之后采用凝胶过滤层析精细纯化,去除杂蛋白。经过两步纯化得到了较高纯度的重组尿酸酶蛋白,酶活力测定均具有较好的比活性。获得纯化的重组尿酸酶后,对其进行结构验证和酶活力的研究。质谱测定了重组尿酸酶的分子量和肽质量图谱,鉴定了重组表达的尿酸酶具有准确和完整的氨基酸序列和一级结构。偶联多角度静态光散射凝胶层析和高效液相色谱实验证实了重组尿酸酶为同源四聚体,且相对于原型尿酸酶,改构氨基酸序列的尿酸酶不易形成高的多聚体,稳定性较好。SDS-PAGE实验说明,高聚体的形成可能是由于亚基中半胱氨酸被氧化形成二硫键所致。酶-底物反应实验测得尿酸酶在不同pH条件下的催化活力和米氏常数Km,改构序列的重组尿酸酶对尿酸有更高的亲和力。为了便于后面进一步的修饰和研究,本课题对去免疫化改构的重组尿酸酶CUOX-D1进行理化分析及活性的研究。重组尿酸酶CUOX-D1的纯度约为98.59%,在280nm处有最大吸收峰,等电点为8.15-8.65。N端均一且与理论N端氨基酸序列完全一样。质谱实测的分子量结合肽图鉴定结果与理论氨基酸序列保持一致。酶活性实验测得CUOX-D1的比活性为3.20U/mg,与原型重组尿酸酶活性相差不大。本课题成功构建了重组尿酸酶大肠杆菌表达体系,初步建立了阴离子交换层析和凝胶过滤层析两步蛋白纯化工艺,并对重组蛋白进行了理化及活性的分析,为提高尿酸酶的稳定性和降低尿酸酶免疫原性的进一步修饰奠定了基础。