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研究背景白内障是全球第一位的致盲眼病,随着全球老龄化的加剧,年龄相关性白内障(age-related cataract, ARC)的发病率还在不断升高。ARC的发生和多种因素相关,氧化应激是其中重要的因素之一。长期慢性的氧化损伤可以导致细胞代谢障碍,产生大量活性氧簇,损伤晶状体上皮细胞的结构和功能,破坏晶状体上皮层的屏障功能,导致晶状体混浊。然而,这一过程的具体机制尚不完全明确。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)是一种多功能细胞因子,在多种细胞的增生、分化、迁移及渗透性调节等方面具有重要作用。VEGF与血管生成和血管通透性增加密切相关,但在无血管的晶状体细胞中也有表达,在眼组织处在低氧环境时其蛋白表达升高。VEGF对成年晶状体的作用以及是否参与ARC的发生目前并不清楚。Src-家族酪氨酸激酶(Src-family tyrosine kinase, SFK)是一种非受体酪氨酸激酶,它参与氧化应激、UV、渗透压变化在多种细胞引起的信号转导通路的激活。我们的前期研究证实SFK异常激活参与了实验性皮质性白内障的发生。对血管内皮细胞的研究发现VEGF可能通过其受体并在c-Src的参与下改变细胞间的连接,影响血管的通透性。那么在晶状体上皮层是否存在同样的信号转导通路的激活而影响了晶状体上皮层的完整性和通透性、进而参与白内障的发生呢?目的观察氧化应激对晶状体上皮细胞VEGF表达的影响,探讨氧化损伤对晶状体上皮细胞间连接的影响以及SFK/VEGF信号通路的激活在其中的作用。方法(1)白内障术中收集ARC患者前房水及前囊膜,用ELISA法检测房水中VEGF含量并搜集患者相关临床资料;间接免疫荧光染色法检测ARC患者前囊膜上晶状体上皮细胞中VEGF的表达。用SPSS 13.0软件分析VEGF表达与相关影响因素的相关性。(2)用不同浓度H2O2 (10 nM~1mM)处理体外培养人晶状体上皮细胞SRA01/04,在培养的各时间点,用ELISA法检测细胞上清液中VEGF的含量变化。(3)用100μM H2O2和/或300 U/ml过氧化氢酶(CAT)处理SRA01/04细胞,用RT-PCR及Western-Blot方法分别从mRNA水平及蛋白水平观察VEGF及Src的表达变化。(4)经300 U/ml CAT、10μM PP1(特异性SFK抑制剂)和/或0.25μg/ml Avastin(VEGF特异性抗体)与100μM H2O2共同处理SRA01/04细胞,用Western-Blot法检测VEGF、p-Src、细胞间连接蛋白ZO-1和N-cadherin的表达变化;用间接免疫荧光染色法,在激光共聚焦显微镜下观察细胞间连接蛋白ZO-1、N-cadherin及细胞骨架蛋白F-actin的表达;流式细胞仪检测细胞周期改变;细胞划痕实验检测细胞移行能力的改变。(5)用100μM H2O2和/或300 U/ml CAT处理离体培养小鼠晶状体,用体式解剖显微镜观察晶状体混浊情况,用RT-PCT及Western-Blot方法检测小鼠晶状体上皮中VEGF、Src在mRNA水平及蛋白水平的表达变化。结果(1) 59例ARC患者(年龄范围为41-90岁)前房水中VEGF平均含量为151.28±2.1μg/ml,spearman秩相关检验分析显示VEGF水平和患者年龄之间具有显著正相关关系(rs = 0.342, P = 0.008)。54岁、65岁、75岁及83岁ARC患者前囊膜间接免疫荧光染色结果显示平均荧光强度为42.91±4.99,50.84±4.54,60.86±3.55,57.59±6.70,经students’-t检验结果显示65岁,75岁及83岁的囊膜标本中VEGF荧光强度和54岁的具有显著统计学差异(t = 2.63,6.56,3.93;P = 0.030,0.000,0.004)。(2)用10 nM ~100μM H2O2刺激晶状体上皮细胞SRA01/04细胞,细胞上清液中VEGF含量随H2O2浓度的提高而升高,并显著高于对照组(F = 14.68, 26.49及35.69;P = 0.00, 0.00及0.00)。在100μM H2O2处理6 h,12 h及24 h后,VEGF含量分别为201.78±8.78μg/ml;323.21±15.81μg/ml;737.32±78.29μg/ml,是相应对照组的1.57,1.58及2.64倍(P < 0.01)。各培养时间点1 mM H2O2处理组较100μM H2O2处理组降低(169.82±10.70μg/ml;314.61±13.33μg/ml及709.85±62.68μg/ml,P = 0.00, 0.44, 0.47)。(3)用100μM H2O2处理SRA01/04细胞,VEGF在mRNA和蛋白水平均随处理时间延长逐渐升高,蛋白水平活性Src(p-Src)的表达也随处理时间延长逐渐升高,在同时使用CAT的组里这些变化可以被有效抑制。(4) 100μM H2O2可以诱导SRA01/04细胞VEGF、p-Src蛋白水平表达上调,破坏ZO-1、N-cadherin及F-actin的正常分布,G2+S期细胞比例增高,细胞移行能力下降。300 U/ml CAT可有效阻止上述变化。10μM PP1和/或0.25μg/ml Avastin与100μM H2O2共同处理后亦可部分阻止H2O2引起的上述改变。(5)用100μM H2O2刺激离体培养的小鼠全晶状体可以诱导晶状体混浊加速及程度加重,并可诱导VEGF及活性Src表达上调,这些改变可被300 U/ml CAT有效抑制。结论ARC患者房水及晶状体前囊膜的上皮细胞中VEGF表达量与患者年龄呈正相关。H2O2可刺激体外培养的人晶状体上皮细胞表达和分泌VEGF。在培养的晶状体上皮细胞及小鼠全晶状体中,H2O2刺激的VEGF及活性Src的表达上调,晶状体混浊形成。H2O2通过激活SFK/VEGF信号通路,破坏晶状体上皮细胞间连接,影响细胞周期及移行,从而参与白内障的形成。